河北醫科大學第四醫院臨床分離厭氧菌分布及耐藥性分析

馮軍花， 何 京， 唐 杰， 李蓉蓉， 鄧艷麗， 張金艷

近年來，隨著臨床微生物檢驗的發展，厭氧菌的檢出率逐步提高，由厭氧菌引起的機會性感染進入臨床診療的視野，其感染部位多發，在血液、腦脊液、腹腔、盆腔等均有報道[1-3]。相比一般細菌，厭氧菌體外分離困難，其培養分離率受標本采集和運輸、孵育氣體環境、培養基成分等多種因素影響，且常因與其他細菌混合感染，臨床檢驗中漏檢率高。厭氧菌感染臨床治療多以經驗治療為主，易造成抗菌藥物的不規范使用[4-5]。通過分離厭氧菌體外行藥物敏感試驗，以調整用藥方案，抗感染治療效果可大幅提高[6]。本研究通過對河北醫科大學第四醫院厭氧菌感染的菌種、感染類型進行流行病學分析，并開展厭氧菌藥物敏感試驗，以期為臨床抗厭氧菌治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集2017年1月—2019年12月，本院檢驗科分離的厭氧菌137株，其中脆弱擬桿菌82株，所有菌株均來自患者非重復感染部位標本。

1.2 方法

1.2.1 菌株復蘇 將EP管中凍存的菌株，轉種于布氏厭氧血瓊脂培養基（美國BBL公司），置于培養罐中使用MPI多功能微生物培養系統抽出空氣，充入厭氧氣體，35℃培養48 h，連續傳代2次后使用。每次傳代同時進行耐氧試驗，即將菌株接種于血瓊脂平板，35℃空氣環境培養48 h,無菌生長即為耐氧試驗合格。

1.2.2 菌株鑒定 受試菌株分別采用16S rRNA測序、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI TOF MS）技術、傳統生化反應卡進行鑒定。測序引 物 27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；質譜儀每批次檢測以大腸埃希菌ATCC 8739作為質控菌株；生化反應卡每批次檢測以卵形擬桿菌ATCC BAA-1296作為質控菌株。

1.2.3 瓊脂稀釋法藥敏試驗 根據美國臨床與實驗室標準化協會（CLSI）M11-A8文件中的規定制備不同濃度梯度抗菌藥物的布氏厭氧血瓊脂。將待測脆弱擬桿菌分別制備成0.5麥氏濁度單位的菌懸液，吸取1 μL接種于瓊脂平板表面，每點接種菌量約為105CFU，形成直徑為5～8 mm的菌斑，按照低濃度到高濃度依次接種。在每個系列平板之間，接種一個不含抗菌藥物的對照平板，用于生長質控和檢測平板接種過程中可能發生的污染。接種10 min后將平板翻轉，置于厭氧培養罐中，35 ℃孵育48 h。每批次檢測以脆弱擬桿菌ATCC 25285作為質控菌株。將平板置于暗色、無反光物體表面上判斷試驗終點，獲取藥物最低抑菌濃度（MIC）。藥敏結果的解釋和質控范圍依據CLSI M100-S29標準判斷。

1.2.4 E試驗法藥敏試驗 配置0.5麥氏濁度單位脆弱擬桿菌菌懸液，均勻涂布于布氏厭氧血瓊脂上，干燥3～10 min后，將各抗菌藥物E試驗條依次置于布氏厭氧血瓊脂上，放入厭氧培養罐中，35 ℃孵育48 h。每批次檢測以脆弱擬桿菌ATCC 25285作為質控菌株。觀察脆弱擬桿菌生長情況，讀取抑菌圈與E試驗條交界處的MIC值。藥敏結果的解釋和質控范圍依據CLSI M100-S29標準判斷。

1.2.5 耐藥基因檢測 按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取脆弱擬桿菌DNA作為模板。PCR擴增耐藥基因：甲硝唑耐藥基因nim、碳青霉烯類耐藥基因cfiA、四環素類耐藥基因tetQ、大環內酯及林可霉素類耐藥基因ermF。引物序列由上海生工公司合成。PCR 擴增體系30 μL：2 × Taq PCR Master Mix 25 μL，模板DNA 2 μL，10 mmol/L上、下游引物各1.5 μL。反應35個循環，引物序列及擴增條件見表1。所得產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察，目的片段純化后由上海生工公司雙向測序，用BLAST軟件與GenBank上已公布的基因序列進行比對。

表1 脆弱擬桿菌耐藥基因擴增引物及擴增條件Table 1 Primers and conditions for amplification of resistance genes in Bacteroides fragilis

1.2.6 統計分析 數據分析采用 SPSS 21.0統計軟件。對瓊脂稀釋法與E試驗法藥敏試驗結果進行Wilcoxon秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 厭氧菌鑒定及分布特征

研究共收集厭氧菌137株，所有菌株均經16S rRNA測序鑒定菌種，共鑒定6個屬、10個種。MALDI TOF MS技術、傳統生化反應卡在種水平鑒定正確率分別為94.2%、85.4%。不同感染部位菌種分布見表2。

2.2 瓊脂稀釋法藥敏分析

共收集脆弱擬桿菌82株，對7種抗菌藥物進行瓊脂稀釋法體外藥敏試驗，采用CLSI M100-S29標準判斷，結果見表3。脆弱擬桿菌對甲硝唑和氯霉素的敏感率較高，均大于90%，其中甲硝唑的敏感率最高（98.8%）；對碳青霉烯類藥物的敏感率僅次于甲硝唑和氯霉素，均為78.0%；對克林霉素的敏感率最低，為2.4%。

2.3 E試驗法藥敏分析

82株脆弱擬桿菌，對7種抗菌藥物進行E試驗法體外藥敏試驗，采用CLSI M100-S29判斷結果，見表4。結果顯示，對甲硝唑的敏感率與瓊脂稀釋法一致，仍為98.8%；氯霉素的敏感率降低（86.6%），出現中介結果；對碳青霉烯類藥物的敏感率均較瓊脂稀釋法有所降低，兩藥分別為74.4%和69.5%；對克林霉素敏感率仍最低，為1.3%。

表2 不同感染部位菌種分布Table 2 Distribution of anaerobic species in terms of infection site

表3 82株脆弱擬桿菌瓊脂稀釋法藥敏試驗結果Table 3 Susceptibility of 82 strains of Bacteroides fragilis tested by agar dilution assay

2.4 瓊脂稀釋法與E試驗法藥敏試驗結果統計分析

針對以上藥敏試驗結果的差異，對兩種方法中甲硝唑、氯霉素、亞胺培南、美羅培南的試驗結果進行Wilcoxon秩和檢驗，判斷總體分布是否有差別。統計結果顯示，瓊脂稀釋法與E試驗法在4種抗菌藥物的MIC分布上均無差異，P均＞0.05。見表5。

表4 82株脆弱擬桿菌E試驗法藥敏試驗結果Table 4 Susceptibility of 82 strains of Bacteroides fragilis tested by Etest method

表5 瓊脂稀釋法與E試驗法藥敏試驗結果統計Table 5 Susceptibility results tested by agar dilution versus Etest method

2.5 脆弱擬桿菌耐藥基因分布

82株脆弱擬桿菌中：甲硝唑耐藥基因nim擴增結果均為陰性；碳青霉烯類耐藥基因cfiA檢出率為22.0%、碳青霉烯類耐藥菌株均攜帶cfiA基因，檢出率為100%；四環素類耐藥基因tetQ檢出率為75.6%、四環素耐藥菌株tetQ基因的檢出率為95.4%；大環內酯及林可霉素類耐藥基因ermF檢出率為72.0%；克林霉素耐藥菌株的ermF基因檢出率為74.7%。

3 討論

厭氧菌作為寄居于人體口腔、腸道的正常菌群，在機體免疫力低下時易導致內源性感染，隨著臨床對厭氧菌認識的加深，其在醫院感染中的檢出率逐步提高[9-11]。本研究結果顯示，臨床送檢標本中共分離出厭氧菌137株，共6個屬、10個種，其中革蘭陰性菌比陽性菌占比高；革蘭陰性菌以脆弱擬桿菌為主，占總株數的59.9%， 革蘭陽性菌以厭氧消化鏈球菌為主，占8.0%。由此可知，脆弱擬桿菌在厭氧菌感染中最為常見[12]，可能與其自身特性有關，即對氧的耐受性較高，在空氣中暴露12 h仍可存活[13-14]。厭氧菌主要在血培養中檢出，占總株數的67.2%，其中又以脆弱擬桿菌檢出率最高，在血流感染菌株中占79.3%。Dumont等[15]報道144株厭氧菌引起的菌血癥中，脆弱擬桿菌占47.2%。可見其引起的菌血癥應當在抗感染治療中受到關注，而血培養厭氧培養瓶采集標本大大提高了厭氧菌的檢出率，相比其他標本，厭氧培養瓶采集血液操作簡單，培養瓶內基質液及厭氧環境均可延長細菌存活時間，在一定程度上避免了假陰性結果[16]。普雷沃菌屬在血液、口咽部膿腫分泌物、肺膿腫穿刺液中均有檢出。Panda等[17]研究發現口咽部鱗狀細胞癌患者口腔中普雷沃菌屬占比有所提高。本研究中口腔分泌物均取自口腔鱗癌患者，其出現由普雷沃菌屬引起的牙周感染可能與此有關。此外，放線菌屬、韋榮球菌屬作為口腔中的常居菌群，易引起免疫功能低下患者口腔黏膜破潰后感染[18]。厭氧消化鏈球菌是本研究中檢出最多的革蘭陽性菌，其在腹腔、口腔、胸腔標本均有分離。Carmel等[19]同樣在綜述中提出厭氧消化鏈球菌可引起胸膜腔、腹壁、牙周的急慢性傷口感染。艱難梭菌作為抗生素相關腹瀉的主要病因，近來隨著微生物檢驗技術的完善其檢出率有所提高。本研究中5株從腸道分離的厭氧菌均為艱難梭菌，長期住院、質子泵抑制劑、廣譜頭孢菌素等抗菌藥物是引起艱難梭菌腹瀉的危險因素[20-21]，需要在臨床抗感染治療中引起重視。

近年，因厭氧菌耐藥導致的抗感染治療失敗時有發生。本研究選取分離最多的脆弱擬桿菌行藥敏試驗，使用CLSI推薦的瓊脂稀釋法，結果發現，甲硝唑的耐藥率為1.2%，與Ghotaslou等[22]報道對甲硝唑耐藥率在0.5%～7.3%相一致。臨床使用甲硝唑抗厭氧菌治療可取得穩定效果；其次對氯霉素的耐藥率6.1%，仍處于較低水平；對碳青霉烯類藥物耐藥率已達22.0%，需要在臨床治療中予以重視；對克林霉素、四環素、阿莫西林-克拉維酸的耐藥率均超過40%，其中克林霉素耐藥率最高，達96.3%。由此可見，厭氧菌的耐藥情況不容樂觀，經驗治療厭氧菌受到限制。但CLSI推薦的瓊脂稀釋法操作煩瑣，一般實驗室開展困難[23]，故本研究對比分析了E試驗法與瓊脂稀釋法的差異，以評估E試驗法的應用價值。通過比較兩種方法抗菌藥物的MIC分布，可見E試驗法檢測MIC出現較多中介結果，抗菌藥物的敏感率稍有下降，但耐藥率基本不變，Wilcoxon秩和檢驗結果顯示，對于甲硝唑、氯霉素、亞胺培南和美羅培南，兩種方法無差異，這與Hughes等[24]報道一致，且E試驗法不用消耗太多的人力、物力，操作相對簡單，可作為對有需要的患者初篩試驗，以避免在抗感染治療中使用耐藥的抗菌藥物，而瓊脂稀釋法可作為確證試驗用于流行病學調查，以明確醫院內厭氧菌的耐藥性變化趨勢，為臨床治療提供依據。

研究中針對脆弱擬桿菌的藥敏試驗情況，對4種耐藥基因進行檢測。甲硝唑作為抗菌活性最高的抗厭氧菌藥物，細菌耐藥多由nim基因介導，但本研究中所有受試菌株PCR擴增均呈陰性，其耐藥可能與產生其他nim基因亞型或細菌的主動外排作用有關[22]；碳青霉烯類耐藥的脆弱擬桿菌均攜帶cfiA基因[25]，其表達與否與碳青霉烯類藥物的MIC密切相關；介導四環素耐藥的tetQ基因可編碼細菌核糖體保護性蛋白，脆弱擬桿菌四環素耐藥多由tetQ基因所致；有研究表明[26]，脆弱擬桿菌對克林霉素的耐藥性已廣泛流行，且對克林霉素的高水平耐藥性是通過ermF基因介導，本研究中脆弱擬桿菌ermF基因攜帶率已達72.0%。

綜上所述，臨床分離厭氧菌以脆弱擬桿菌為主，以血流感染最為常見，E試驗法對于檢測脆弱擬桿菌的藥物敏感性具有一定價值，可對臨床抗厭氧菌治療提供幫助。