川崎病小鼠模型心功能演變過(guò)程研究

婁萍，焦富勇，張雪梅，張丹，趙穎，趙欣，王俊香，金晶，曹玲

川崎病（Kawasaki disease，KD）又稱為小兒皮膚黏膜淋巴結(jié)綜合征，是一種以全身中小動(dòng)脈炎癥病變?yōu)橹饕卣鞯募毙悦庖呦到y(tǒng)疾病［1］，其病因不明。相關(guān)研究表明，KD可能與感染、遺傳和超抗原因素有關(guān)［2-3］。KD好發(fā)于5歲以下兒童，其可導(dǎo)致患兒發(fā)生嚴(yán)重心血管病變，以冠狀動(dòng)脈損傷最為嚴(yán)重，包括冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張和冠狀動(dòng)脈瘤形成，最終導(dǎo)致患兒心肌缺血、心肌梗死等，目前其已取代風(fēng)濕熱而成為我國(guó)小兒后天性心臟病的主要病因之一［4］。本研究通過(guò)干酪乳桿菌細(xì)胞壁成分（lactobacillus casei cell wall extract，LCWE）誘導(dǎo)小鼠KD模型，并觀察其心功能的演變過(guò)程，旨在探討KD對(duì)心功能的影響。

1 材料和方法

1.1 LCWE制備 本實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2020年1月。將干酪乳桿菌（貝納細(xì)胞生物保存管理中心，第134415號(hào)）培養(yǎng)于乳酸菌肉湯培養(yǎng)基中24 h，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期收集細(xì)菌，添加4% SDS裂解，4 000 r/min離心30 min（離心半徑8 cm），使用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）反復(fù)沖洗，加入250 μg/ml RNase、DNase和胰蛋白酶，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，使用PBS再次清洗后收集細(xì)菌碎片，并取1 g濕重加入5 ml PBS，冰浴，使用超聲細(xì)胞破碎儀處理2 h（超聲5 s、間隙5 s，功率300 W），將處理后的溶液離心1 h（4 ℃，15 600 r/min、離心半徑8 cm），配置成LCWE的終液。

1.2 動(dòng)物制備 隨機(jī)選擇50只BALB/c小鼠〔北京維頓利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)許可證SCXK（北京）2016-0006，銷售許可證SYXK（陜西）2012-005〕，體質(zhì)量（17.0±0.5）g,無(wú)特定病原體，將其分成模型組30只和對(duì)照組20只，并分別編寫序號(hào)。模型組小鼠經(jīng)腹腔注射LCWE的終液，單次注射0.5 ml；對(duì)照組小鼠不做任何處理。

1.3 方法 檢測(cè)對(duì)照組及模型組小鼠建模后2 d、15 d、30 d心功能指標(biāo)，具體如下：將小鼠胸口毛脫掉，放入密封盒中，吸入異氟烷將其麻醉，仰臥位固定在檢查臺(tái)上，同步記錄小鼠心率。將超聲探頭固定在檢查支架上，當(dāng)小鼠心率穩(wěn)定在400～500次/min時(shí)，胸口涂抹超聲耦合劑，進(jìn)行超聲檢查，通過(guò)調(diào)節(jié)檢查支架的角度及探頭方向而探查小鼠左心室長(zhǎng)軸切面，采用M超記錄左心室壁運(yùn)動(dòng)情況，同時(shí)記錄左心室舒張 末 期 內(nèi) 徑（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD）和左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular endsystolic diameter，LVESD），并計(jì)算左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）及左心室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS），連續(xù)采集5個(gè)心動(dòng)周期，并儲(chǔ)存于后臺(tái)，所用儀器為加拿大VISUALSONIC公司Vevo3100型高分辨率小動(dòng)物超聲心動(dòng)圖儀，選用Mx400單晶片機(jī)械扇掃寬頻探頭，固定聚焦深度為1.2 cm。

1.4 病理檢查 對(duì)照組及造模后2 d、15 d、30 d模型組分別處死1只小鼠并取出心臟標(biāo)本，立即置于體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醛溶液固定。常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、連續(xù)切片，蘇木素-伊紅（HE）染色及彈力纖維染色（EVG），使用光學(xué)電子顯微鏡（德國(guó)蔡司Zeiss Axio lab.A1）進(jìn)行觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料先行正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布以（±s）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 左心室壁運(yùn)動(dòng)情況 M超檢查結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠左心室壁運(yùn)動(dòng)幅度正常。造模后2 d，模型組6只（占20.0%）小鼠出現(xiàn)左心室壁運(yùn)動(dòng)幅度略減低，其中左心室前壁減低2只、左心室后壁減低4只；造模后15 d，模型組13只（占44.8%）小鼠出現(xiàn)左心室壁運(yùn)動(dòng)幅度明顯減低，其中左心室壁普遍減低5只、左心室前壁減低3只、左心室后壁減低5只；造模后30 d，模型組8只（占28.6%）小鼠仍處于左心室壁運(yùn)動(dòng)幅度減低狀態(tài)，其中左心室壁普遍減低4只、左心室前壁減低2只、左心室后壁減低2只，見(jiàn)圖1。

圖1 M超檢查結(jié)果Figure 1 Test results of M- ultrasound

2.2 左心功能指標(biāo) 造模后2 d模型組小鼠LVESD和LVFS低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值分別為2.149、2.097，P值均＜0.05）；造模后15 d模型組小鼠LVEDD、LVESD、LVEF及LVFS低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值分別為4.167、2.434、2.930、3.716，P值均＜0.05）；造模后30 d模型組小鼠LVEDD、LVEF及LVFS低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值分別為3.604、2.986、3.184，P值均＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 對(duì)照組與模型組小鼠LVEDD、LVESD、LVEF及LVFS（±s）Table 1 LVEDD，LVESD，LVEF and LVFS of the control group and the model group

表1 對(duì)照組與模型組小鼠LVEDD、LVESD、LVEF及LVFS（±s）Table 1 LVEDD，LVESD，LVEF and LVFS of the control group and the model group

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；LVEDD=左心室舒張末期內(nèi)徑，LVESD=左心室收縮末期內(nèi)徑，LVEF=左心室射血分?jǐn)?shù)，LVFS=左心室短軸縮短率

組別 只數(shù) LVEDD（mm） LVESD（mm） LVEF（%） LVFS（%）對(duì)照組 20 4.32±0.67 3.10±0.37 54.11±9.18 26.27±4.78造模后2 d模型組 30 4.07±0.91 2.79±0.48a 49.44±10.39 22.44±6.09a造模后15 d模型組 29 3.53±0.44a 2.73±0.52a 42.27±14.46a 18.83±7.02a造模后30 d模型組 28 3.72±0.22a 2.96±0.31 43.05±12.74a 20.55±5.93a

2.3 病理檢查結(jié)果 病理檢查結(jié)果顯示，造模后2 d，小鼠心臟組織結(jié)構(gòu)正常，內(nèi)膜及肌壁間局部可見(jiàn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖2A；造模后15 d，小鼠心外膜高度腫脹，可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞、少量單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，其內(nèi)（左）冠狀動(dòng)脈管腔擴(kuò)張及少量心肌細(xì)胞壞死崩解，見(jiàn)圖2B；造模后30 d，小鼠左冠狀動(dòng)脈管壁增厚，彈力纖維不連續(xù)，心外膜血管擴(kuò)張，間質(zhì)水腫，可見(jiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維結(jié)締組織彌漫輕度增生，見(jiàn)圖2C。

圖2 模型組小鼠病理檢查結(jié)果Figure 2 Pathological examination results of the model group

3 討論

KD主要是T淋巴細(xì)胞亞群失衡后機(jī)體免疫系統(tǒng)異常活躍、內(nèi)皮細(xì)胞受損，從而引發(fā)的血管炎癥，其常累及人體的多個(gè)臟器。既往研究表明，72%～91%的KD會(huì)引起心臟病變［5］。KD最常累及冠狀動(dòng)脈，可引發(fā)冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張、冠狀動(dòng)脈瘤形成，嚴(yán)重者形成血栓，進(jìn)而導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈狹窄甚至閉塞［6］。1979年，LEHMAN利用LCME在小鼠身上成功誘導(dǎo)出動(dòng)脈炎癥，主要使中動(dòng)脈、冠狀動(dòng)脈及大動(dòng)脈根部受累，能很好地模擬冠狀動(dòng)脈損傷過(guò)程，是較成熟的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?］。

高頻超聲心動(dòng)圖可以直觀、清晰地顯示小鼠心臟結(jié)構(gòu)，可動(dòng)態(tài)觀察心臟改變，且具有無(wú)創(chuàng)性［8］。M超可以記錄小鼠心臟的運(yùn)動(dòng)幅度，測(cè)量左心室大小，并客觀評(píng)價(jià)心功能變化［9］，是一種較理想的檢查方式。但小鼠心功能指標(biāo)的參考范圍目前并未明確，故本實(shí)驗(yàn)將正常小鼠作為對(duì)照。

研究表明，通過(guò)觀察心室壁節(jié)段性運(yùn)動(dòng)可較早評(píng)估冠狀動(dòng)脈缺血情況［10］。本研究結(jié)果顯示，造模后2 d，模型組6只（占20.0%）小鼠出現(xiàn)左心室壁運(yùn)動(dòng)幅度略減低，對(duì)照組與造模后2 d模型組小鼠LVEDD和LVEF比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示KD急性期心臟受損程度可能還沒(méi)有影響心功能，這與KD患兒急性期臨床表現(xiàn)基本一致（疾病第1周內(nèi)，患兒超聲心動(dòng)圖通常是正常的［11］），也說(shuō)明該階段KD尚未侵犯到心臟。本研究結(jié)果顯示，造模后15 d，模型組13只（占44.8%）小鼠出現(xiàn)左心室壁運(yùn)動(dòng)幅度明顯減低，LVEDD、LVESD、LVEF和LVFS低于對(duì)照組，病理檢查結(jié)果顯示小鼠心外膜高度腫脹，可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞、少量單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，該階段模型組小鼠心臟已符合KD心肌炎表現(xiàn)。KD患兒心肌炎表現(xiàn)主要是左心室收縮功能不全和心動(dòng)過(guò)速，其中導(dǎo)致左心室收縮功能不全的主要原因是彌漫性心肌炎性損傷引起的心肌纖維化［12］，最終可使患兒發(fā)生充血性心力衰竭。既往研究表明，KD患兒心肌炎發(fā)生早、急性左心功能不全出現(xiàn)短暫［13］。本研究結(jié)果顯示，造模后30 d，模型組8只（占28.6%）小鼠仍處于左心室壁運(yùn)動(dòng)幅度減低狀態(tài)，LVEDD、LVEF及LVFS低于對(duì)照組。本研究結(jié)果還顯示，KD模型小鼠異常的室壁運(yùn)動(dòng)節(jié)段主要出現(xiàn)在左心室前壁及后壁，而左心室前壁和后壁是左冠狀動(dòng)脈前降支及回旋支的供血區(qū)域［14］。冠狀動(dòng)脈炎管壁的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈狹窄和心肌微灌注異常［15］，使心肌呈現(xiàn)出供血不足的表現(xiàn)。

綜上所述，利用LCWE誘導(dǎo)KD小鼠模型，能夠動(dòng)態(tài)觀察KD小鼠心功能演變過(guò)程，模擬KD對(duì)心臟功能的影響。但由于小鼠在測(cè)量過(guò)程中受到外力、環(huán)境及麻醉等影響，會(huì)使其心臟發(fā)生短暫的運(yùn)動(dòng)異常，即出現(xiàn)假陽(yáng)性表現(xiàn)，因此實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可以延長(zhǎng)觀察、記錄時(shí)間或讓小鼠短暫休息后再次測(cè)量，盡量避免假陽(yáng)性結(jié)果及影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

作者貢獻(xiàn)：婁萍進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，并撰寫論文；焦富勇進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析；婁萍、趙穎、趙欣、王俊香、曹玲進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；張丹、金晶進(jìn)行結(jié)果分析與解釋；張雪梅進(jìn)行論文的修訂；焦富勇、張雪梅負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校；婁萍、張雪梅對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無(wú)利益沖突。