miR-34a-5p過表達靶向抑制MET對肝癌細胞HepG2惡性增殖、侵襲和腫瘤形成的影響

楊慧萍，朱夢佳，王 淋，趙文霞，陳 雨

肝細胞癌是位于人類肝臟中的常見腫瘤。由于手術切除，轉移和異質性的復雜性，肝細胞癌被認為是世界上3大最致命的腫瘤之一。在肝癌的臨床治療中已經采用了許多治療策略，包括藥物干預、化學栓塞、保守治療和手術治療，但是由于缺乏對病理機制的深刻理解，肝癌的臨床治療效果仍不理想。微小RNA(microRNA，miRNA)可有效地調節各種生物過程，進一步研究miRNA的表達模式和作用可能為肝癌提供新的診斷和治療靶標。

miR-34a-5p是miR-34a家族成員，可調節多種細胞的增殖和侵襲。已有研究表明miR-34a-5p在肝癌組織中表達明顯低于非肝癌肝組織。間質表皮轉化因子(mesenchymal to epithelial transition factor，MET)是PTKs家族成員，MET表達水平與肝癌的術后復發、生存時間關系密切，可作為肝癌術后預后指標。該文通過熒光素酶報告實驗驗證miR-34a-5p與MET靶向關系，探討miR-34a-5p過表達對HepG2細胞增殖、侵襲及腫瘤生長的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

10只雄性4～5周齡Balb/c裸鼠，體質量18～22 g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，動物許可證號：SCXK(川)2020-030，所有裸鼠均飼養于特定的無病原體條件下。

1.2 實驗試劑

RPMI-1640培養基、胎牛血清、青霉素/鏈霉素雙抗溶液、胰蛋白酶購自美國Gibco 公司；熒光素酶檢測試劑盒購自北京solarbio公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術研究所；兔抗人Ki67、增殖細胞核抗原(proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA)、Bax(ab53154)、B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Caspase-3、cleaved caspase-3、β-actin均購自英國Abcam公司。

1.3 細胞培養

人肝癌細胞株HepG2來源于中國典型培養物保藏中心，將細胞接種于RPMI 1640培養基(含10 %胎牛血清、1×10U/L青霉素/鏈霉素雙抗溶液)中，于恒溫培養箱(5 % CO、37 ℃)中培養。實驗用細胞為對數生長期細胞。

1.4 RT-PCR

通過采用TRIzol溶液從HepG2細胞中抽提總RNA，反轉錄獲得cDNA，按SYBR PremixEX Taq Ⅱ試劑盒說明書進行檢測。反應條件為：預變性95 ℃ 2 min，變性95 ℃、5 s，60 ℃、10 s，95 ℃、5 s，40個循環，60 ℃、1 min。miR-34a-5p上游引物為：5′-AGCCGCTGGCAGTGTCTTA-3′，下游引物為：5′-CAGAGCAGGGTCCGAGGTA-3′；U6上游引物為：5′- ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，下游引物為：5′- GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。以U6為內參，miR-34a-5p的相對表達使用公式2計算。

1.5 熒光素酶報告實驗

通過生物信息學網站targetscan分析顯示MET是miR-34a-5p的潛在靶點，采用熒光素酶報告實驗進行驗證，構建野生型和突變型MET 3、UTR熒光素酶報告基因質粒，轉染至HepG2細胞。采用熒光素酶檢測試劑盒檢測細胞熒光素酶相對活性。

1.6 MET過表達

構建MET pcDNA載體過表達MET，轉染至HepG2細胞，將細胞隨機分為3組：Control、pcDNA和pcDNA-MET組。通過RT-PCR和Western blot確定過表達是否成功。

1.7 細胞分組

miR-34a-5p mimic與pcDNA-MET單獨或聯合轉染肝癌HepG2細胞，Control組、miR-34a-5p mimic組(mimic)、pcDNA-MET組(MET)和miR-34a-5p mimic+pcDNA-MET組(mimic+MET)。

1.8 克隆形成實驗

取方法1.7轉染后的各組細胞，按500個/孔接種于6孔板，于恒溫培養箱(5 % CO、37 ℃)中培養14 d，當出現肉眼可見的克隆時，4 %多聚甲醛固定30 min，0.5 %結晶紫染色30 min，拍照觀察克隆形成數目，計算細胞克隆形成率。細胞克隆形成率=細胞克隆數/接種細胞數×100%。

1.9 流式細胞儀檢測細胞凋亡

收集方法1.7轉染后培養48 h的細胞，PBS清洗2遍，加入結合緩沖液制成細胞懸液，避光加入5 μl AnnexinⅤ-FITC和5 μl PI混勻，孵育15 min，采用流式細胞儀上機分析，檢測各組細胞凋亡率。

1.10 Transwell

將基質膠均勻鋪至Transwell小室上室，并加入100 μl細胞懸液 (10/ml)，下室加入500 μl完全培養基，37 ℃孵育24 h后多聚甲醛固定20 min， 0.1 %結晶紫染色20 min，于熒光顯微鏡隨機選擇5個視野計數穿模細胞數。

1.11 Western blot

取方法1.7轉染后各組細胞，用含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白含量。采用SDS-PAGE凝膠電泳法分離蛋白質樣品并轉移至PVDF膜，于4 ℃條件下加入MET、Ki67、PCNA、Bax、Bcl-2和Caspase-3一抗(1 ∶1 000)孵育過夜，TBST清洗，4 ℃條件下加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1 ∶10 000)孵育2 h，ECL顯影發光并曝光處理。通過ImageJ軟件分析灰度值，以目的條帶灰度值/Actin灰度值表示蛋白表達水平。

1.12 裸鼠皮下移植瘤模型

將荷瘤裸鼠隨機分成2組：Control和mimic組，取方法1.7對數生長期的Control和mimic組細胞，調整接種HepG2細胞濃度為1×10/ml，接種于裸鼠右側腋窩處(皮下注射，0.2 ml)。每5 d測量1次移植瘤的體積，30 d后處死裸鼠，剝離腫瘤并稱取瘤子重量。

1.13 免疫組化

取部分腫瘤組織，石蠟包埋切片，切片厚度為4 μm，按免疫組化檢測試劑盒說明書進行免疫組化染色，DAB顯色，蘇木精復染1 min，鹽酸乙醇分化2 s，顯微鏡下觀察Ki67表達情況，Ki67陽性細胞定位于細胞和，陽性表達為細胞核染成黃色或棕黃色。

1.14 TUNEL

取方法1.13切片，按TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書加TUNEL反應液，光學顯微鏡下隨機選取5個視野并計數凋亡細胞。凋亡陽性細胞核為有棕黃色著染者，正常細胞呈藍色。腫瘤組織細胞凋亡率(%)=腫瘤組織凋亡細胞數量/腫瘤組織總細胞數×100%。

2 結果

2.1 miR-34a-5p靶向下調MET

為明確miR-34a-5p對MET的靶向關系，采用熒光素酶報告實驗進行驗證，搜索生物信息學網站獲得MET 3′UTR序列如圖1A所示，MET Wt加入miR-34a-5p mimic處理后熒光素酶活性降低(

F

=33.40，

P

<0.05，圖1D)，表明miR-34a-5p和MET存在靶向作用關系。RT-PCR檢測miR-34a-5p、MET mRNA水平(圖1B、C)，與Control組比較，mimic組miR-34a-5p mRNA水平升高(

t

=1.226，

P

<0.05)，MET mRNA水平降低(

t

=2.040，

P

<0.05)。

圖1 miR-34a-5p與MET靶向關系

2.2 MET過表達升高MET mRNA水平和蛋白表達水平

構建MET pcDNA載體，通過RT-PCR和Western blot確定過表達是否成功(圖2)，與Control組比較，pcDNA-MET組MET mRNA水平和蛋白水平均升高(

t

=1.615、1.270，

P

<0.05)。

圖2 MET過表達對MET mRNA水平和蛋白表達水平的影響

2.3 miR-34a-5p過表達抑制HepG2細胞增殖，降低Ki67、PCNA蛋白表達水平

通過克隆形成法檢測各組細胞增殖情況(圖3A)，與Control組比較，mimic組細胞克隆形成率降低(

t

=1.750，

P

<0.05)，MET組細胞克隆形成率升高(

t

=4.000，

P

<0.05)，mimic+MET組細胞克隆形成率低于MET組(

t

=3.125，

P

<0.05)；通過Western blot檢測各組細胞Ki67、PCNA蛋白表達水平(圖3C)，與Control組比較，mimic組細胞Ki67、PCNA蛋白水平降低(

t

=1.316、1.381，

P

<0.05)，MET組細胞Ki67、PCNA蛋白水平升高(

t

=1.880、2.000，

P

<0.05)，mimic+MET組細胞Ki67、PCNA蛋白水平低于MET組(

t

=1.802、1.830，

P

<0.05)。

2.4 miR-34a-5p過表達促進HepG2細胞凋亡，升高Bax/Bcl-2、cleaved Caspase-3/Caspase-3比值

通過流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況(圖4A)，與Control組比較，mimic組細胞凋亡率升高(

t

=1.402，

P

<0.05)，MET組細胞凋亡率降低(

t

=4.035，

P

<0.05)，mimic+MET組細胞凋亡率高于MET組(

t

=1.516，

P

<0.05)；通過Western blot檢測各組細胞Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達水平(圖4B)，與Control組比較，mimic組細胞Bax/Bcl-2、cleaved Caspase-3/Caspase-3比值升高(

t

=1.157、1.270，

P

<0.05)，MET組細胞Bax/Bcl-2、cleaved Caspase-3/Caspase-3比值降低(

t

=1.200、2.333，

P

<0.05)，mimic+MET組細胞Bax/Bcl-2、cleaved Caspase-3/Caspase-3比值高于MET組(

t

=1.058、1.400，

P

<0.05)。

2.5 miR-34a-5p過表達抑制HepG2細胞侵襲

通過Transwell檢測各組HepG2侵襲細胞數(圖5)，與Control組比較，mimic組侵襲細胞數降低(

t

=1.886，

P

<0.05)，MET組侵襲細胞數升高(

t

=5.542，

P

<0.05)。與MET組比較，mimic+MET組侵襲細胞數降低(

t

=2.803，

P

<0.05)。

圖3 miR-34a-5p過表達對HepG2細胞克隆形成率和Ki67、PCNA蛋白表達水平的影響 × 200

圖4 miR-34a-5p過表達對HepG2細胞凋亡和Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達水平的影響

2.6 miR-34a-5p過表達對肝癌裸鼠移植瘤的影響

與Control組比較，mimic組第25、30天腫瘤體積降低(

t

=2.103、2.029，

P

<0.05)，腫瘤組織重量降低(

t

=1.820，

P

<0.05)，mimic組Ki67陽性細胞數降低(

t

=1.271，

P

<0.05)，腫瘤組織細胞凋亡率升高(

t

=1.141，

P

<0.05)。見圖6。

3 討論

越來越多的研究顯示，miRNA的表達失控與肝癌的發生發展密切相關。在腫瘤中，miRNA常常起到抑癌基因或癌基因的作用。相關研究表明，在乳腺癌骨轉移中，miR-34a-5p的缺失與MET的表達呈負相關。本研究表明miR-34a-5p和MET存在直接靶向作用關系，miR-34a-5p可能是治療肝癌的有效潛在靶點。

調控腫瘤細胞的增殖是治療腫瘤的重要方式。Ki67屬于增殖相關蛋白，其表達水平的高低可評估癌細胞的增殖能力。PCNA是一種與細胞增殖狀態有關的核蛋白，PNCA指數越高，細胞的分裂增殖越快，有可能促進細胞獲得無限增殖的能力并最終使細胞的形態結構和機能發生改變。張亞飛 等發現miR-34a-5p靶向GMFB抑制SH-SY5Y細胞增殖。Sun et al發現上調肝癌細胞中miR-34a-5p表達可抑制肝癌細胞增殖。本研究顯示miR-34a-5p過表達靶向抑制MET通過降低克隆形成率、Ki67及PCNA蛋白表達量，提示miR-34a-5p過表達抑制HepG2細胞增殖。且降低肝癌裸鼠移植瘤模型腫瘤組織Ki67陽性細胞數，提示miR-34a-5p過表達抑制肝癌裸鼠移植瘤模型腫瘤組織細胞增殖。

圖5 miR-34a-5p過表達對HepG2細胞侵襲的影響 ×200

圖6 miR-34a-5p過表達對肝癌裸鼠移植瘤的影響 ×200

腫瘤治療最本質的策略是誘導腫瘤細胞的凋亡，細胞凋亡是發生在響應異常和細胞損傷的重要細胞機制，異常凋亡反應在許多類型的人類癌癥的發生發展過程中十分常見。相關研究表明，Bax/Bcl-2比值升高誘導細胞凋亡，Bax/Bcl-2比值降低細胞凋亡受到抑制，在肝癌細胞中miRNA主要通過Bcl-2家族來影響細胞凋亡。Caspase蛋白的改變是細胞凋亡發生的重要標志，而Caspase-3是以無活性的前體存在，在細胞接受到一系列的凋亡信號后Caspase-3經過剪切成為活化的執行因子Caspase-3，其是細胞凋亡不可逆的標志。李勤 等發現miR-34a-5p過表達可促進滋養層細胞凋亡。馮婉琴 等發現miR-34a-5p mimic促進子宮內膜基質細胞凋亡。miR-34a-5p過表達靶向抑制MET具有升高HepG2細胞Bax/Bcl-2、cleaved Caspase-3/Caspase-3比值和升高肝癌裸鼠移植瘤腫瘤組織細胞凋亡率的作用。提示miR-34a-5p過表達靶向抑制MET促進HepG2細胞凋亡和裸鼠腫瘤組織細胞凋亡。

大量研究表明，肝癌預后不良的原因在于肝癌細胞的侵襲和轉移能力，抑制肝癌細胞的侵襲活力是治療肝癌的重要方式。李鵬 等發現上調miR-34a-5p靶向TPD52抑制膀胱癌細胞侵襲。本文表明miR-34a-5p過表達靶向抑制MET具有降低HepG2細胞侵襲細胞數的作用。提示miR-34a-5p過表達靶向抑制MET抑制HepG2細胞侵襲。

綜上所述，miR-34a-5p過表達靶向MET抑制抑制HepG2細胞增殖、侵襲，誘導細胞凋亡，抑制裸鼠移植瘤腫瘤的形成。以miR-34a-5p為靶點的干預治療有望成為肝癌治療的新方法, 值得臨床進一步研究探討。