miR-485-5p介導SOX5基因表達對肝細胞肝癌細胞活力及遷移侵襲的影響

韓成美，柳 梅，任維鑫，朱英斌，陳茂麗

微小RNA(microRNA, miRNA)被報道通過調控其靶基因的表達在腫瘤的發生發展中發揮關鍵作用。miR-485-5p在腫瘤中被發現表達異常，在膠質瘤和非小細胞肺癌等惡性腫瘤中表達減少，可抑制腫瘤的惡性進展。miR-485-5p抑制肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的增殖和遷移侵襲能力。性別決定區Y框蛋白5(sex determinant Y box protein 5, SOX5)在HCC中促進細胞的遷移和侵襲能力，SOX5在HCC中是否發揮其它的生物學作用，以及SOX5是否作為miR-485-5p的靶基因參與HCC的發生發展引起課題組的關注，該文對此及其可能的作用機制進行了研究，旨在獲得miR-485-5p作為HCC治療潛在靶點的重要實驗室依據。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本收集

收集2018年6月—2019年10月入住山東第一醫科大學附屬濟南人民醫院行手術治療的HCC患者的癌組織和癌旁組織，癌旁組織為距離腫瘤組織邊緣3 cm以上的非癌肝組織，癌組織和癌旁組織均經病理專家確認。要求收集臨床樣本為首次行手術切除的病灶，并在術前未經放化療等任何形式的治療。將切除的PTC及癌旁組織立即凍存于-80 ℃液氮中。所有患者簽署知情同意書，本研究由本院倫理委員會審核批準通過。

1.2 主要試劑材料

TRIzol試劑和qRT-PCR Kit試劑盒購自日本TaKaRa公司；Bestar 1st Strand cDNA合成試劑盒購自上海DBIBioscience公司；miR-485-5p、SOX5、內參U6和β-actin引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；HCC細胞Huh7購自上海中國科學院；高糖培養基、胎牛血清(fetal Bovine Serum, FBS)和胰酶購自美國Hyclone公司；pGL6-TA-SOX5-野生型質粒(SOX5-wt)、pGL6-TA-SOX5-突變型質粒(SOX5-mut)、miR-485-5p mimic和過表達SOX5質粒購自上海吉凱基因有限公司；雙熒光素酶報道基因檢測試劑盒購自北京索萊寶試劑有限公司；CCK8試劑購自日本同仁化學；Transwell小室購自美國coring公司；蛋白裂解液和BCA檢測試劑盒購自美國Thermo公司；PVDF膜購自邁博瑞生物膜技術有限公司；pAkt(66444-1-Ig，1 ∶2 000)抗體購自美國proteintech公司和pGSK3β(ab75814，1 ∶1 000)抗體購自英國Abcam公司。

1.3 細胞培養和轉染

Huh7快速復蘇后立即重懸至高糖培養基中，FBS濃度為10%。細胞培養在37 ℃、5% CO的全濕度培養箱中。細胞生長狀態較好時，胰酶消化收集細胞，以每孔1×10個細胞傳至6孔板中，分為NC、miR-485-5p mimic和miR-485-5p mimic+oe-SOX5組。細胞接種12 h后采用lip2000進行各組轉染，無關序列對照轉染NC組細胞，miR-485-5p 模擬物(mimic)轉染miR-485-5p mimic組細胞，miR-485-5p mimic和過表達SOX5質粒同時轉染miR-485-5p mimic+oe-SOX 5組細胞，放至培養箱中培養48 h后進行后續實驗。

1.4 qRT-PCR

HCC組織研磨成粉末后，加入TRIzol試劑，冰上完全裂解，提取組織中的總RNA。Huh7細胞長滿后，PBS洗1遍，加入TRIzol試劑，提取細胞中總RNA。測得RNA的濃度和純度后。按照85 ℃、5 s，37 ℃、15 min反應條件采用逆轉錄試劑盒體系將RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，按照95 ℃預變性5 s，40個95 ℃變性5 s、65 ℃退火延伸34 s反應條件，采用qRT-PCR試劑盒體系測得各樣品的循環閾值(threshold cvcle，Ct)，按照2公式以U6為內參計算HCC組織和細胞中miR-485-5p的相對表達量，以β-actin為內參計算SOX5 mRNA的相對表達量。miR-485-5p引物序列F: 5′-AGAGGCTGGCCGTGATG-3′, R: 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。SOX5引物序列F: 5′-CAGCCAGAGTTAGCACAATAGG-3′, R: 5′-CTGTTGTTCCCGTCGGAGTT-3′。U6引物序列F: 5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′, R: 5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。β-actin引物序列F: 5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′, R: 5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′。

1.5 雙熒光素酶報告實驗

TargetScan7.1在線軟件(http://www.targetscan.org/)預測miR-485-5p可能的靶基因。以1.4中的cDNA為模板，通過PCR擴增包含miR-485-5p結合位點的SOX 5 3'UTR片段，SOX5引物進行SOX5基因片段擴增，采用XbaI和XhoI雙酶切位點將擴增的SOX5片段插入到pGL6-TA質粒中熒光素酶基因的下游，獲得pGL6-TA-SOX5-野生型質粒(SOX5-wt)。以同樣的方法將突變片段插入到pGL6-TA質粒中，獲得pGL6-TA-SOX5-野生型質粒(SOX5-wt)。Huh7細胞長滿時，胰酶消化收集細胞，以每孔2 000個傳至96孔板中，分為NC+SOX5-wt組(無關序列對照與SOX5-wt質粒同時轉染)、miR-485-5p+SOX5-wt組(miR-485-5p mimic與SOX5-wt質粒同時轉染)、NC+SOX5-mut組(無關序列對照與SOX5-mut質粒同時轉染)、miR-485-5p+SOX5-mut組(miR-485-5p mimic與SOX5-mut質粒同時轉染)，放至培養箱中培養48 h。按照雙熒光素酶報道基因檢測試劑盒說明書檢測各組細胞的熒光素酶活性。

1.6 CCK-8實驗

Huh7細胞長滿后，PBS洗1遍，胰酶消化收集細胞，以每孔1 500個細胞傳至96孔板中，分為NC、miR-485-5p mimic和miR-485-5p mimic+oe-SOX5組，按上述轉染的方法進行各組細胞的轉染。分別在細胞轉染0、24、48和72 h時，每孔加入10 μl CCK-8試劑，放置培養箱中繼續培養2 h。酶標儀檢測490 nm處各樣品的吸光度值。

1.7 Transwell實驗

胰酶消化收集轉染48 h的各組細胞，無血清高糖培養基洗2次，以1×10個細胞重懸至100 μl無血清高糖培養基中。細胞懸液加入到Transwell小室中，并將Transwell小室放入加有500 μl含有10% FBS的完全培養基中。放置37 ℃、5% CO的全濕度培養箱中培養。12 h左右終止培養，PBS將未穿過的細胞洗去后，甲醇固定細胞，蘇木精進行染色，顯微鏡下拍照，計數細胞穿膜的個數。

1.8 Western blot檢測蛋白表達

胰酶消化收集轉染48 h的各組細胞，PBS洗1遍后，加入蛋白裂解液，超聲裂解30 min，14 000 r/min、4 ℃離心30 min。采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。加入上樣緩沖液后煮沸蛋白變性。定量蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白經濕性轉膜方法轉移至PVDF膜上，5% BSA常溫孵育PVDF膜1 h，pAkt、pGSK3β 和內參GAPDH一抗稀釋液4 ℃孵育過夜，二抗稀釋液室溫孵育1 h，ECL試劑盒曝光蛋白條帶。

2 結果

2.1 miR-485-5p對SOX5的靶向調控作用

TargetScan 7.1軟件在線預測顯示SOX5的3′UTR與miR-485-5p具有結合位點，見圖1A。雙熒光素酶報告基因試驗結果顯示：與NC+SOX5-wt組相比，miR-485-5p+SOX5-wt組的熒光素酶活性降低(

t

=4.031,

P

=0.021)；而NC+SOX5-mut和miR-485-5p+SOX5-mut組間的熒光素酶活性差異無統計學意義(

t

=1.052,

P

=0.067)，見圖1B。

圖1 miR-485-5p對SOX5的靶向調控作用

2.2 miR-485-5p和SOX5在HCC組織中的表達水平

qRT-PCR檢測結果顯示與癌旁組織相比，HCC組織中miR-485-5p的表達降低(

t

=2.747,

P

=0.008)。與癌旁組織相比，HCC組織中SOX5 mRNA的表達增加(

t

=5.697,

P

<0.001)，見圖2。

2.3 miR-485-5p和SOX5在HCC組織中表達的相關性

采用Pearson線性相關分析檢測HCC組織中miR-485-5p與SOX5的表達相關性，按照miR-485-5p在HCC組織中的平均相對表達量0.73為界，將40例HCC患者分為miR-485-5p高表達(18例)和miR-485-5p低表達(22例)。SOX5在HCC組織中的平均相對表達量1.43為界，將40例HCC患者分為SOX5高表達(19例)和SOX5低表達(21例)，結果顯示miR-485-5p與SOX5在HCC組織中的表達呈負相關(

r

=-0.701，

P

=0.004)。

2.4 各組細胞轉染效率的檢測

Huh7轉染miR-485-5p mimic，與NC組相比，miR-485-5p mimic組中miR-485-5p的表達增加(

t

=6.331,

P

=0.010)，表明miR-485-5p mimic成功轉染HCC細胞，見圖3A。與NC組相比，miR-485-5p mimic組細胞中SOX5 mRNA的表達降低(

t

=4.050,

P

=0.018)，表明miR-485-5p負調控SOX5的表達，見圖3B。Huh7轉染SOX5過表達質粒，與NC組相比，oe-SOX5組細胞中SOX5蛋白的表達增加(

t

=8.041,

P

<0.001)，見圖3C。表明SOX5過表達質粒成功轉染HCC細胞。

圖2 qRT-PCR檢測miR-485-5p和SOX5在HCC組織中的表達水平

2.5 miR-485-5p調控SOX5對HCC細胞活力的影響

CCK-8實驗結果顯示，與NC組相比，miR-485-5p mimic組和miR-485-5p mimic+oe-SOX5組Huh7細胞活力降低。而與miR-485-5p mimic 組相比，miR-485-5p mimic+oe-SOX5組Huh7細胞活力增加，SOX5 減弱miR-485-5p mimic對HCC細胞活力的抑制作用。見圖4。

2.6 miR-485-5p調控SOX5對HCC細胞遷移侵襲能力的影響

Transwell實驗結果顯示，NC組Huh7細胞穿膜數為(128.33±10.57)個，miR-485-5p mimic組Huh7細胞穿膜數為(32.67±3.84)個，miR-485-5p mimic+oe-SOX5組Huh7細胞穿膜數為(64.33±9.78)個。與NC組相比，miR-485-5p mimic組和miR-485-5p mimic+oe-SOX5組Huh7細胞遷移侵襲能力降低(

t

=13.871,

P

<0.001；

t

=5.952,

P

=0.009)。與miR-485-5p mimic 組相比，miR-485-5p mimic+oe-SOX5組Huh7細胞遷移侵襲能力增加(

t

=4.863,

P

=0.012)，SOX5 減弱miR-485-5p mimic對HCC細胞遷移侵襲能力的抑制作用。見圖5。

圖3 各組細胞轉染效率的檢測

圖4 miR-485-5p調控SOX5對Huh7細胞活力的影響

圖5 miR-485-5p調控SOX5對Huh7細胞遷移侵襲能力的影響 ×200

2.7 miR-485-5p調控SOX5對Akt/GSK3β的影響

Western blot實驗結果顯示，與NC組相比，miR-485-5p mimic組和miR-485-5p mimic+oe-SOX5組Huh7細胞中pAkt和pGSK3β蛋白表達降低。與miR-485-5p mimic 組相比，miR-485-5p mimic+oe-SOX5組Huh7細胞中pAkt和pGSK3β蛋白表達增加，SOX5 減弱miR-485-5p mimic對Akt/GSK3β信號通路的抑制作用。見圖6、表1。

圖6 miR-485-5p負靶向調控SOX5對Akt/GSK3β的影響

表1 各組細胞中Akt/GSK3β信號通路蛋白的相對表達量

3 討論

miRNA是長度約為18～25個核苷酸的一類小非編碼單鏈RNA分子，包括惡性腫瘤在內的各種人類疾病中表達異常，并且被認為是抗腫瘤治療的候選靶點。miR-485-5p位于14q32號染色體的人類基因組區域。miR-485-5p在多種腫瘤中發揮抑癌基因的作用，miR-485-5p在結直腸癌中低表達抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲能力，并促進細胞的凋亡。miR-485-5p的表達顯著抑制了食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。越來越多的證據集中在miR-485-5p在腫瘤發生發展過程中的功能上，Gao et al報道miR-485-5p在HCC中表達下調，并通過負調控WBP2抑制HCC細胞增殖、遷移侵襲能力和促進細胞凋亡。miRNA通過與它們靶基因的3'非翻譯區結合來抑制其靶基因信使RNA的表達是miRNA發揮調控作用的重要機制，每個miRNA的靶基因可能存在成千上百個。TargetScan7.1軟件是可以在線預測miRNA與其靶基因結合位點的網站，本文在此網站上發現miR-485-5p與SOX5 mRNA的3'非翻譯區具有結合位點，并且采用雙熒光素酶報道基因證實SOX5為miR-485-5p的靶基因。

SOX5是SOX家族轉錄因子的成員，具有高遷移率族DNA結合基序的保守序列，在調節胚胎發育和決定細胞命運方面具有重要作用。SOX5的最新研究主要集中在腫瘤上，在胰腺癌和非小細胞肺癌等腫瘤中，促進腫瘤細胞的遷移、侵襲和維持腫瘤干細胞干性等方面具有重要的作用。Wang et al報道SOX5在HCC組織和細胞系中表達上調，并通過調控上皮間質轉化過程促進腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。雙熒光素酶報道實驗提示miR-485-5p可能通過調控SOX5在HCC中發揮作用。本文采用qRT-PCR檢測顯示與癌旁組織相比，HCC組織中miR-485-5p的表達顯著下調，而SOX5的表達顯著上調，與已有的研究一致。但是person相關分析顯示，miR-485-5p與SOX5在HCC組織中的表達呈負相關，并且采用mimic轉染HCC細胞過表達miR-485-5p后顯示HCC細胞中SOX5 mRNA的表達降低，表明miR-485-5p靶向負調控SOX5。采用MTS和Transwell實驗檢測miR-485-5p調控SOX5在HCC中的生物學功能，結果表明與NC組相比，miR-485-5p mimic組和miR-485-5p mimic+oe-SOX5組HCC細胞的增殖和侵襲遷移能力降低，而與miR-485-5p mimic組相比，miR-485-5p mimic+oe-SOX5組HCC細胞的增殖和侵襲遷移能力增加，表明miR-485-5p通過負調控SOX5抑制HCC的細胞的惡性表型。為了進一步研究miR-485-5p調控SOX5發揮作用的機制，本文采用Western blot實驗檢測miR-485-5p調控SOX5對Akt/GSK3β信號通路的影響，Akt/GSK3β信號通路是與腫瘤增殖和侵襲遷移能力相關的腫瘤重要調控途徑，包括HCC。Akt/GSK3β信號通路中關鍵蛋白Akt和GSK3β發生磷酸化激活(pAkt和pGSK3β)促使其下游信號分子發生促腫瘤發生發展的表達改變。本文結果顯示SOX5減弱miR-485-5p對Akt/GSK3β信號通路活化的抑制作用。表明miR-485-5p負調控SOX5抑制Akt/GSK3β信號通路活化參與HCC的發生發展。

綜上所述，miR-485-5p和SOX5的表達在HCC中呈負相關。miR-485-5p負調控SOX5抑制HCC細胞增殖和侵襲遷移能力，作用機制可能是通過抑制Akt/GSK3β信號通路的活化。miR-485-5p和SOX5可能是抗HCC治療的分子靶標。