連翹酯苷A通過TLR4/NF-κB抑制PC12細胞低氧/再復氧誘導的炎癥反應

馬忠英，張 迪，孫 金，牛 靜，任 茜，武倩雯，王婧雯

腦缺血引起的神經元壞死和活性氧釋放觸發炎癥級聯反應，同時，血腦屏障受損，過量的免疫細胞進入腦組織，與腦內固有免疫相互作用，放大炎癥反應，加重腦損傷。炎癥反應貫穿腦損傷的發生發展過程，調節炎癥反應，將有可能減輕腦損傷程度。連翹具有清熱、抗炎等功效，連翹酯苷A(forsythoside A，FA)是其主要成分之一。FA可抑制低糖低血清、谷氨酸和Aβ25-35誘導的神經細胞損傷，此外， FA表現出很好的抗炎效果。PC12細胞是大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞，具有典型的神經細胞特征，廣泛應用于神經疾病模型研究。該研究擬在前期基礎上，進一步研究FA對氧糖剝奪/再灌注(oxygen and glucose deprivation/reperfusion，OGD/R)引起的PC12細胞損傷的作用，并闡明作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

藥品和試劑

FA(純度>98%)購自北京索萊寶科技有限公司；細胞培養用胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)、DMEM培養基和胰蛋白酶購自美國GIBICO公司；白細胞介素(interleukin，IL)-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor - alpha，TNF-α)和IL-6購自上海碧云天生物有限公司；Toll樣受體4 (toll-like receptor-4，TLR4)、I-κB、P-I-κB、核轉錄因子kappa B (nuclear factor kappa B，NF-kB)、PCNA和GAPDH抗體購自美國Cell signaling 公司；TLR4慢病毒激活顆粒、NF-κB慢病毒激活顆粒和轉染試劑均購自美國Santa Cruz公司；其余試劑均是分析純。

1.1.2 儀器

低溫離心機、CO培養箱、低氧小管和全波長酶標儀均購自美國Thermo公司；凝膠電泳系統和化學發光系統購自美國Bio-Rad公司。

1.1.3 細胞

大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞PC12細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.2 細胞培養

細胞采用含10% FBS的DMEM培養基在37 ℃的CO培養箱中培養，每2 d換液1次。細胞融合至90%左右時，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，800 r/min離心5 min收集細胞，加入新鮮培養基按1 ∶3進行傳代培養。待細胞生長至對數期，收集細胞，根據實驗目的接種于96孔板或者6孔板中，進行藥物處理和造模。實驗分組(

n

=6)：正常(正常條件培養)、模型(OGD/R)和給藥組(1.25、2.5和5 μmol/L，細胞預處理24 h后，進行OGD/R)。FA的給藥劑量根據前期MTT實驗結果篩選而來。

1.3 OGD/R模型

給藥組采用FA預處理24 h，然后將含藥培養基換成無血清培養液，將培養板放置于含95% N的缺氧小室中，繼續培養3 h，低氧結束后，將無血清培養液換成含藥培養基，培養6 h，完成再復氧。模型組再灌注時給予正常培養基進行再灌注，正常組采用正常培養基在正常條件下培養。收集各組細胞，根據不同實驗目的進行處理。

1.4 炎癥因子測定

收集細胞培養基上清液，在1 500 r/min，4 ℃條件下離心5 min，按照試劑盒說明書繪制標準曲線，然后測定培養基中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量，每個樣本設定5個復孔，450 nm測定各孔吸光度值。通過標準曲線計算樣品中炎癥因子的濃度。

1.5 細胞轉染

轉染試劑采用Lipofectamine 3000進行。選擇合適密度細胞接種于6孔板中，培養24 h；用Opti-MEM培養基稀釋Lipofectamine 3000，充分混合并標記為1號管；用Opti-MEM培養基稀釋質粒制成預混液，充分混合并標記為2號管；1號和2號管混合，充分混勻，室溫孵育15 min，制成質粒-脂質體復合物。將復合物滴加入需轉染細胞組，繼續培養48 h，檢測轉染效率，進行后續處理。

1.6 Western blot

檢測 細胞經過不同處理后，收集各組細胞，細胞裂解液在4 ℃裂解20 min，10 000 r/min離心15 min，收集上清液，分裝，在-20 ℃冷凍保存。用BCA蛋白含量測定試劑盒測定每組的蛋白質含量。10% SDS-PAGE分離蛋白，濕法轉膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉60 min后，孵育一抗(TLR4、I-κB、P-I-κB、NF-κB p65、PCNA和GAPDH抗體，1 ∶1 000稀釋)，4 ℃過夜。洗凈一抗后，孵育羊抗兔二抗，60 min，37 ℃。最后，TBST洗凈殘余二抗后，ECL發光液進行顯色，掃描灰度值，計算與正常組的比值。內參蛋白為GAPDH。

1.7 統計學處理

數據統計采用Graphpad Prism 9.0進行分析，用表示，各組間的比較采用單因素方差分析檢驗，以

P

<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FA抑制炎癥因子水平

如圖1所示，正常組與模型組上清液中IL-1β含量比較差異有統計學意義(

F

=46.13，

P

<0.01)。正常組上清液中TNF-α含量與模型組上清液中IL-1β含量比較差異有統計學意義(

F

=70.51，

P

<0.01)。正常組上清液中IL-6含量與模型組上清液中IL-1β含量比較差異有統計學意義(

F

=10.68，

P

<0.01)。這些結果表明OGD/R使PC12細胞產生炎癥反應。與模型組比較，FA使細胞上清液中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量降低，差異有統計學意義(

P

<0.01)，并且呈劑量依賴關系，表明FA可抑制OGD/R引起的炎癥反應。

圖1 FA對炎癥因子水平的影響

2.2 FA對NF-κB核轉移的影響

如圖2所示，模型組細胞內P-I-κB和NF-κB p65細胞質中表達量均增加，并且與正常組比較差異有統計學意義(

F

=58.24，

F

=47.67，

P

<0.01)。同時，圖2B結果顯示，模型組細胞的細胞核內NF-κB p65的表達量增加(

F

=49.27，

P

<0.01)，表明OGD/R不僅促進NF-κB p65蛋白表達，還可促進其轉移入核。而FA處理組細胞質內P-I-κB和NF-κB p65表達量降低(

P

<0.01)，同時細胞核內NF-κB p65表達量也減少，并差異有統計學意義(

P

<0.01)，表明FA可抑制NF-κB p65從細胞質向細胞核轉移。

2.3 FA通過抑制NF-κB調控炎癥反應

為驗證FA的抗炎作用是否通過調控NF-κB，采用質粒轉染過表達NF-κB。如圖3A所示，過表達NF-κB使細胞質和細胞核中NF-κB p65表達量均增加，表明質粒轉染成功。如圖3B所示，過表達NF-κB后，FA對細胞核中NF-κB p65表達的抑制作用減弱，與FA處理組差異有統計學意義(

F

=143.6，

P

<0.01)。同時，FA對IL-6的抑制作用被減弱(

F

=70.88，

P

<0.01)，表明FA通過NF-κB發揮抗炎作用。

2.4 FA對TLR4蛋白表達的影響

如圖4所示，模型組細胞內TLR4蛋白表達量增加，且與正常組比較差異有統計學意義(

F

=59.01，

P

<0.01)，表明OGD/R可以激活細胞內TLR4通路。而FA處理組，TLR4蛋白表達量被抑制，且與模型組比較差異有統計學意義(

P

<0.01)，表明FA可抑制TLR4的蛋白激活。

圖2 FA對NF-κB表達的影響

圖3 FA通過抑制NF-κB抑制炎癥反應

圖4 FA對TLR4蛋白表達的影響

2.5 FA通過TLR4調控NF-κB活性

為驗證FA是否通過TLR4發揮抗炎作用，采用質粒過表達TLR4。如圖5A所示，過表達使TLR4蛋白表達量增加，表明細胞轉染成功，同時，課題組還觀察到FA可使TLR4表達減少，進一步說明FA對TLR4具有抑制作用。圖5B結果顯示，與scrb+FA組比較，過表達TLR4組細胞核內NF-κB p65蛋白表達升高(

F

=206.5，

P

<0.01)，表明過表達TLR4使FA對NF-κB的抑制作用減弱。同時，ELISA結果顯示(圖5C)，過表達TLR4使細胞內IL-6含量升高(

F

=57.32，

P

<0.01)，與FA+scrb組比較差異有統計學意義，表明過表達TLR4FA對炎癥的抑制作用減弱。

3 討論

炎癥反應在腦缺血和再灌注引起的腦損傷過程中具有十分重要的作用，并且影響患者的臨床預后。炎癥反應還可與其他腦損傷機制(氧化應激、線粒體應激等)交互影響，共同促進腦組織損傷。因此，抑制炎癥反應是治療腦卒中，改善患者預后的重要途徑。前期研究表明，FA具有一定的抗炎效果，但是否能夠通過抑制炎癥反應發揮腦保護作用還未見報道。本研究通過體外OGD/R模型，研究了FA的抗炎作用，并初步闡明了可能的作用機制。

OGD/R可升高細胞培養基上清液中炎癥因子(IL-1β、TNF-α和IL-6)的含量，表明OGD/R引起PC12細胞發生炎癥反應。而FA處理組細胞內炎癥因子水平被抑制，且與模型組比較差異有統計學意義，表明FA可抑制細胞內的炎癥反應。這些結果表明，FA在PC12細胞模型上具有抗炎效果。

圖5 FA通過TLR4調節NF-κB表達

為闡明FA的抗炎作用機制，本研究測定了TLR4/NF-κB信號通路。TLR4是在人類中發現的第一個TLR，在炎癥免疫過程中發揮重要作用。機體內的炎癥因子可識別TLR4并與其結合，誘導下游通路激活，進一步促進炎癥反應，這種誘導放大效應可加重炎癥反應和組織損傷。TLR4通過髓樣分化因子88促使NF-κB和I-κB解離，NF-κB p65從細胞質轉移至細胞核，與其核轉錄因子結合后，誘導炎癥因子(TNF-α和IL-6等)釋放，誘導產生和加重炎癥反應。因此，有效抑制TLR4/NF-κB通路可阻斷炎癥反應的級聯關系，減輕炎癥反應和組織損傷。

本研究結果顯示，OGD/R不僅升高細胞質NF-κB p65的表達水平，同時細胞核中NF-κB p65表達水平也增加，表明FA激活NF-κB p65通路。為進一步驗證FA對NF-κB的調控作用，采用慢病毒顆粒過表達NF-κB，結果顯示過表達NF-κB使FA對細胞核內NF-κB p65蛋白表達的抑制作用減弱，同時失去對IL-6的抑制作用，表明FA通過抑制NF-κB抑制炎癥反應。為進一步明確FA對TLR4的調控作用，測定了TLR4的蛋白表達情況。結果表明，FA可抑制TLR4表達，同時采用慢病毒質粒進一步證實FA通過TLR4調控NF-κB發揮抗炎作用。

綜上所述，FA能夠抑制OGD/R誘導的PC12細胞炎癥反應，其作用機制可能是通過抑制TLR4/NF-κB信號通路減少炎癥因子釋放，從而減輕細胞炎癥損傷。本研究為進一步開發利用FA提供理論基礎，將加速該藥的推廣應用。