miR-205促進hASCs細胞系向軟骨細胞方向分化的作用及機制研究

李春亮，秦 鳳，韓雪來，齊普良，孫凱華，趙子春，唐保明，李澤清，李釗偉，王 凱

外傷或疾病引起的關節軟骨缺損或損傷是臨床常見病，關節軟骨損傷后自我修復能力十分有限。人脂肪干細胞(human adipose-derived stem cells，hASCs)具有向脂肪、軟骨等多向分化潛能及分布廣泛、易取材等優勢，已成為軟骨組織工程理想的種子細胞。核心結合因子α-1(core-binding factor α-1，Cbfα-1)是hASCs向軟骨細胞分化、肥大成熟過程中重要的特異性轉錄調控因子，尋找Cbfα-1相對應的基因啟動元件進而調控該基因表達，對hASCs細胞的分化至關重要。研究證實，微小RNA(microRNA，miRNA)可通過靶向調控Cbfα-1介導多能干細胞成骨或軟骨分化，其中miR-205在調節多能干細胞成骨分化過程中起重要作用，且可抑制Cbfα-1蛋白表達。目前，關于miR-205對hASCs軟骨細胞分化的調控作用研究較少。為獲得可穩定向軟骨細胞方向分化的hASCs細胞，該研究采用慢病毒轉染法將miR-205轉染入hASCs細胞，觀察過表達miR-205對hASCs細胞增殖、軟骨細胞方向分化的影響及調控機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

細胞

hASCs購自澳賽爾斯生物技術(上海)有限公司。

1.1.2

主要試劑和儀器 含miR-205序列的重組慢病毒載體(Lenti-miR-205)、陰性對照Lenti-control慢病毒載體(由上海基凱基因化學技術有限公司測序及慢病毒包裝)，病毒滴度為1×10CFU/ml；Lenti-miR-205、Lenti-control慢病毒液(深圳市默賽爾生物醫學科技發展有限公司);兔抗人Cbfα-1、轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、信號傳導蛋白3(signal transduction protein 3，Smad3)、II型膠原(type Ⅱ collagen，ColⅡ)多抗、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG(美國R&D Systems公司)；BCA蛋白定量試劑盒(北京普利萊基因技術有限公司)；EL×800酶標儀(美國BioTek公司)；7900實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；E-Gel Imager凝膠成像儀(美國Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1

細胞培養及鑒定

體外快速復蘇hASCs細胞系，調整細胞密度接種至6孔板內，置于5% CO、飽和濕度、37 ℃條件下培養，匯合至80%左右按照1 ∶3比例傳代，倒置顯微鏡下觀察細胞形態。收集第3代細胞，PBS重懸細胞，加入CD29、Sca-1、CD34、CD45各1 μl，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌后重懸，于流式細胞儀上檢測細胞表面標志物表達。

1.2.2

細胞轉染及分組 采用慢病毒轉染法將Lenti-miR-205、Lenti-control慢病毒液分別轉染至hASCs細胞(感染復數MOI為20)，分別命名為miR-205過表達組、miR-NC組、對照組(未處理細胞)，每組設置5個復孔。miR-205序列5′-CATGACCGTGACGCTGTCGCA-3′，另選miR-205無關通用序列即Lenti-control為對照，倒置熒光顯微鏡下觀察確認轉染效率>70%，進行后續實驗。

1.2.3

轉染后各組miR-205基因表達檢測 收集轉染48 h各組細胞，采用SYBR PCR試劑盒擴增，進行RT-qPCR，設置反應條件為：95 ℃預變性2 min；95 ℃、20 s，57 ℃、40 s，72 ℃、60 s，40個循環后再延伸5 min(72 ℃)，以U6為內參對照組，計算miR-205相對表達量(2)。引物序列：miR-205：F:5′-GCGTACTAGCGTATGATG-3′，R:5′-ATAGGGATGCTCCGTTGC-3′；U6：F:5′-CTGACTGTTGCAGTGATG-3′，R:5′-TATTGGATGGCGACTGTA-3′。

1.2.4

雙熒光素酶實驗驗證miR205與Cbfα-1的靶向關系 由廣州銳博生物公司合成和鑒定包含miRNA可能結合位點的Cbfα-1 mRNA的3′UTR質粒，對數生長期hASCs細胞，培養至80%融合度時，按照Lipofectamine2000說明書，將Cbfα-1 mRNA 3′UTR野生型與突變型熒光素酶報告質粒與內參海腎熒光素酶質粒pRLTK共轉染至hASCs細胞(對照組)，并分別轉染至miR-NC組細胞、miR-205過表達組細胞，孵育48 h后采用熒光素酶試劑盒檢測熒光素酶強度，計算相對熒光素酶活性值=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.2.5

轉染后hASCs細胞增殖情況檢測 轉染后，分別取第3代hASCs細胞，以1.5×10/ml接種至96孔板，于培養第1、3、7 天時分別加入新下制備MTT溶液20 μl，37 ℃繼續孵育4 h后，棄去培養基，加入DMSO 150 μl，充分振蕩，于490 nm波長處測定吸光度(A)值。

1.2.6

轉染后誘導分化 平面培養法直接將第3代hASCs細胞接種至放有多聚賴氨酸處理的無菌蓋玻片的6孔板，微團培養法將細胞先接種至離心管，離心棄去上清液(2次)，將細胞團塊重新接種至放有多聚賴氨酸處理的無菌蓋玻片的6孔板。培養24 h后，更換成軟骨誘導培養基(DMEM高糖培養基、5%胎牛血清、10 μg/L TGFβ1、50 nmol/L抗壞血酸、0.1 μmol/L地塞米松、6.25 mg/L胰島素、6.25 mg/L轉鐵蛋白)，繼續培養，誘導分化2周，倒置相差顯微鏡觀察細胞分化情況。

1.2.7

分化鑒定 誘導分化2周后，收集平面培養法誘導的細胞爬片，加入4%多聚甲醛固定10 min，蒸餾水洗滌。① 甲苯胺藍染色：加入甲苯胺藍染色15 min，蒸餾水再次洗滌，晾干后中性樹脂封片，顯微鏡下觀察甲苯胺藍染色情況。② Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色：加入封閉液室溫封閉10 min，加入兔抗人Ⅱ型膠原多抗，4 ℃孵育過夜，PBS洗滌后加入生物素標記山羊抗兔IgG，顯色后，蘇木精復染，鹽酸酒精分化，流動自來水沖洗10 min后，脫水、封片，于顯微鏡下觀察，棕黃色染色為陽性。③ 收集微團培養法誘導的細胞爬片，固定方法同甲苯胺藍染色，PBS洗滌3次后，用0.5% Triton X-100進行透化處理8 min，PBS再次洗滌后，加入10%山羊血清濕盒孵育30 min，PBS洗滌3次，加入II型膠原一抗(1 ∶100)4 ℃孵育過夜，PBS洗滌3次，二抗(1 ∶500)室溫避光孵育1 h，PBS洗滌3次，加入熒光抗淬滅劑封片，于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.8

分化后Cbfα-1、Smad3、TGF-β1、ColⅡ mRNA表達檢測 用RT-qPCR法檢測誘導分化2周后細胞中Cbfα-1、Smad3、TGF-β1、ColⅡ mRNA表達情況，檢測方法同1.4描述；以β-actin為內參對照組，計算目的基因表達強度(2)。引物序列：Cbfα-1：F:5′-AGATGTGATTCTACGGCCT-3′，R:5′-CTGCATGTCGAACTACCAC-3′；Smad3：F:5′-GTGATGCCATGATGCTGAT-3′，R:5′-CTGAATGCTGATGCTACTG-3′；TGF-β1：F:5′-TCGAATGCTGCTCTATGA-3′，R:5′-GTGCCTGCTGATTGATGC-3′；ColⅡ：F:5′-ATGCTGATGTCGATGCA-3′，R:5′-CGCATGCTGTGATTGAG-3′；β-actin：F:5′-CTCGTGACTGAAGGATGC-3′，R:5′-TGATGTGAATGCCTGGTG-3′。

1.2.9

分化后Cbfα-1、Smad3、TGF-β1、ColⅡ蛋白表達檢測 收集誘導分化2周各組細胞，離心后取沉淀，加入500 μl細胞裂解液，冰上裂解25 min，再次離心取上清液，BCA法進行蛋白定量，取待測樣本進行SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳，經電轉、封閉后，按照比例稀釋一抗(兔抗人Cbfα-1、Smad3、TGF-β1、ColⅡ多抗)、二抗(HRP標記的山羊抗兔IgG)，進行孵育，最后曝光、顯影；掃描拍照后灰度值分析，以目的蛋白條帶灰度值與內參對照的比值代表相對表達量。

2 結果

2.1 原代hASCs細胞形態觀察及鑒定

原代hASCs細胞培養1 d開始貼壁，細胞呈卵圓形；培養至第3天，細胞開始增殖，逐漸伸展呈梭形或多角形生長，細胞體積增大；培養至第7天，細胞大量增殖，呈長梭形或旋渦狀生長，排列有序，見圖1。流式細胞術鑒定第3代hASCs細胞表面標志物CD29、Sca-1表達陽性，陽性率分別為99.8%、98.4%；CD34、CD45表達陰性，陽性率分別為22.0%、4.96%，符合hASCs細胞表面抗原表達，見圖2。

2.2 轉染后hASCs細胞miR-205基因表達量

轉染后miR-205過表達組、miR-NC組、對照組miR-205基因相對表達量分別為(1.76±0.20)、(0.35±0.05)、(0.37±0.05)，組間比較差異有統計學意義(

F

=217.811，

P

<0.001)；miR-205過表達組miR-205基因相對表達量高于miR-NC組和對照組(

q

=15.294、15.077，均

P

<0.001)，miR-NC組和對照組比較差異無統計學意義(

q

=0.632，

P

=0.545)。

圖1 原代hASCs細胞形態 ×100 A：培養1 d；B：培養3 d；C：培養7 d

圖2 第3代hASCs細胞表面標記流式細胞術檢測結果

2.3 雙熒光素酶實驗結果

miR-205過表達組、miR-NC組、對照組野生型熒光素酶報告質粒相對活性值分別為(0.56±0.09)、(1.01±0.15)、(1.03±0.13)，組間比較差異有統計學意義(

P

<0.05)；與對照組和miR-NC組比較，miR-205過表達組Cbfα-1 mRNA 3′UTR野生型熒光素酶報告質粒相對活性值下降，差異有統計學意義(

P

<0.001)，對照組與miR-NC組比較，差異無統計學意義；miR-205過表達組、miR-NC組、對照組突變型熒光素酶報告質粒相對活性值分別為(1.02±0.10)、(1.02±0.12)、(0.98±0.11)，組間比較差異無統計學意義。見圖3。

圖3 Cbfα-1 mRNA 3′UTR與miR-205互補配對的結合位點

2.4 轉染后hASCs細胞增殖

miR-205過表達組培養3、7 d MTT試驗A值高于對照組和miR-NC組(

P

<0.05)，而對照組與miR-NC組比較，差異無統計學意義；3組MTT試驗A值隨培養時間延長呈升高趨勢(

P

<0.05)。見表1。

表1 轉染后hASCs細胞不同時刻MTT試驗A值

2.5 轉染后誘導hASCs細胞向軟骨細胞分化

誘導hASCs細胞分化2周后，甲苯胺藍染色顯示miR-205過表達組細胞染色呈深藍色，細胞內呈現藍紫色顆粒，集落生長區域細胞藍紫色染色尤為明顯，呈強陽性(圖4A3)，對照組和miR-NC組為微弱淺藍色，呈弱陽性(圖4A1、A2)。免疫細胞化學染色顯示，miR-205過表達組細胞及胞外基質棕黃色，呈強陽性(圖4B3)，對照組和miR-NC組為淡黃色，弱陽性，Ⅱ型膠原表達較少(圖4B1、B2)。免疫熒光染色顯示，miR-205過表達組紅色熒光強度較強(圖4C3)，對照組和miR-NC組紅色熒光強度較暗淡(圖4C1、C2)。

2.6 誘導分化后Cbfα-1、Smad3、TGF-β1、ColⅡ mRNA表達

miR-205過表達組誘導分化后Cbfα-1 mRNA相對表達量低于對照組和miR-NC組，Smad3、TGF-β1、ColⅡ mRNA相對表達量高于對照組和miR-NC組(

P

<0.05)，而對照組與miR-NC組比較，差異無統計學意義。見表2。

表2 誘導分化后Cbfα-1、Smad3、TGF-β1、 ColⅡ mRNA相對表達量

2.7 誘導分化后Cbfα-1、Smad3、TGF-β1、ColⅡ蛋白表達

miR-205過表達組誘導分化后Cbfα-1蛋白相對表達量低于對照組和miR-NC組，Smad3、TGF-β1、ColⅡ蛋白相對表達量高于對照組和miR-NC組(

P

<0.05)，而對照組與miR-NC組比較，差異無統計學意義。見表3、圖5。

表3 誘導分化后Cbfα-1、Smad3、TGF-β1、 ColⅡ蛋白相對表達量

3 討論

關節軟骨損傷是骨性關節炎、老年性關節炎等關節軟骨退行性疾病的重要病理特征。隨著軟骨組織工程學的不斷發展，為軟骨損傷、缺損的修復帶來新的方向。種子細胞的選擇、刺激種子細胞軟骨細胞分化是軟骨組織工程的關鍵步驟。既往研究顯示，骨髓間充質干細胞受生長分化因子刺激后可向軟骨細胞方向分化，但在分化后期存在軟骨肥大細胞易凋亡的缺陷，尋找合適的種子細胞，同時維持干細胞向軟骨細胞分化的穩定性十分重要。Cbfα-1是干細胞軟骨分化晚期重要的轉錄調控因子，抑制Cbfα-1的表達對維持干細胞軟骨細胞分化的穩定性有重要意義。

圖4 轉染后誘導hASCs細胞向軟骨細胞分化

圖5 Cbfα-1、Smad3、TGF-β1、ColⅡ蛋白Western blot條帶圖 A：對照組；B：miR-NC組；C：miR-205過表達組

本研究中顯微鏡觀察hASCs細胞形態由卵圓形逐漸呈梭形或多角形，后逐漸增殖為排列有序的長梭形或旋渦狀，經歷生長停滯期、對數生長期及平臺期，與既往報道結果相似。miR-205是miRNA家族成員之一，具有miRNA調節細胞增殖、分化、凋亡等多種生理過程的作用。既往多將miR-205作為腫瘤抑制因子廣泛研究，近年來研究顯示，miR-205參與調節間充質干細胞軟骨方向分化，但具體機制不明，過表達miR-205可靶向抑制Cbfα-1基因，從而逆轉miR-205對人胰腺癌細胞的增殖和侵襲能力；Zhang et al在研究骨肉瘤MG63、U2OS細胞抑癌實驗中得出了相似的結論。本研究采用慢病毒轉染法使miR-205基因過表達，結果顯示轉染后miR-205基因相對表達量明顯升高，提示轉染成功；采用雙熒光素酶試驗驗證了miR-205與Cbfα-1間的靶向關系；miR-205過表達組轉染后hASCs細胞培養3、7 d MTT試驗A值高于對照組和miR-NC組，且誘導分化2周后，甲苯胺藍染色、免疫細胞化學染色、免疫熒光染色均顯示miR-205過表達組細胞向軟骨細胞方向分化更為明顯，提示抑制miR-205表達可促進hASCs細胞增殖及軟骨細胞方向分化。

此外，miR-205過表達組誘導分化后Cbfα-1 mRNA和蛋白相對表達量低于對照組和miR-NC組，Smad3、TGF-β1、ColⅡ mRNA和蛋白相對表達量高于對照組和miR-NC組，提示miR-205過表達可能通過抑制Cbfα-1，激活TGF-β1/Smad3信號通路發揮促進hASCs細胞增殖及軟骨細胞方向分化的作用。Cbfα-1是軟骨細胞發育過程的重要轉錄因子，可能通過激活細胞內某靶分子而引起TGF-β1/Smad3信號通路激活，發揮相應調控作用，但具體調控機制仍需要進一步探索。研究顯示，Cbfα-1基因缺失可引起成骨特異性骨鈣素基因表達抑制，從而進而避免多能干細胞分化為肥大軟骨細胞和成骨細胞。因此可推測，抑制Cbfα-1基因表達可為hASCs細胞分化為穩定軟骨細胞提供條件。TGF-β1促進多能干細胞向軟骨細胞分化多肽類生長因子，Smad3是其下游重要信號蛋白分子，直接參與TGF-β1信號轉導過程，參與調控軟骨細胞增殖、分化。Col Ⅱ是軟骨細胞功能基因，是維持軟骨網架系統、調節軟骨細胞生長代謝的重要因子。本研究通過促進miR-205過表達，使Cbfα-1基因和蛋白表達抑制，激活TGF-β1/Smad3軟骨細胞增殖、分化信號通路，從而發揮促進hASCs細胞增殖、軟骨細胞方向分化作用。