miR-214-3p通過靶向調(diào)節(jié)p53增強胃癌細胞的轉(zhuǎn)移能力

周大新，謝方利，劉海科，丁 鵬，毛作周，孫 凱，俞 磊，姚衛(wèi)洲，姜連春，李祥兵，劉 聰，吳麗穎

胃癌是國內(nèi)發(fā)病率排名第二的惡性腫瘤，也是最常見的癌癥相關(guān)死亡原因之一。早期診斷和及時手術(shù)切除為早期胃癌患者帶來了良好的生存質(zhì)量和較長的生存期。然而晚期胃癌，因其常經(jīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腹膜擴散而復(fù)發(fā)，預(yù)后很差;對于晚期胃癌患者，采用以手術(shù)治療為主，聯(lián)合圍手術(shù)期化療、放療、生物靶向治療等手段的綜合治療，從而延長患者生存期，改善其生存質(zhì)量，但治療效果仍不理想。

目前，微小RNA(micro RNA,miRNA)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用正在受到廣泛關(guān)注，眾多國內(nèi)外文章報道m(xù)iRNA表達的改變與人類腫瘤的進展和不良預(yù)后高度相關(guān)。同樣，胃癌中miRNA的異常表達也會對疾病的進程產(chǎn)生促進或者抑制作用。對于致癌的miRNA，用miRNA抑制劑可以有效地抑制miRNA在體內(nèi)的功能；而對于腫瘤抑制性miRNA，用miRNA模擬物可起到抗腫瘤作用。因此，某些miRNA可以作為癌癥診斷和治療的靶標(biāo)。該研究觀察了miR-214-3p在胃癌組織中的表達情況以及對胃癌細胞轉(zhuǎn)移能力的影響，并深入探索了其發(fā)生作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

SYBR Green熒光定量PCR反應(yīng)試劑盒購自北京TransGen生物公司。miRNA模擬物及抑制物由上海吉瑪制藥公司設(shè)計合成；p53過表達質(zhì)粒由上海吉瑪制藥公司構(gòu)建；實驗所用引物及內(nèi)參均由上海生工公司設(shè)計合成。Lipofect 3000轉(zhuǎn)染試劑購自于美國Invirogen公司；Transwell小室及Matrigel 基質(zhì)膠購自于美國Corning公司。螢光素酶報告實驗檢測試劑盒購自美國Promega生物公司。

1.2 臨床組織標(biāo)本

收集淮北市人民醫(yī)院2018年12月—2020年7月經(jīng)手術(shù)治療切除的41對胃癌和對應(yīng)的癌旁正常新鮮組織樣本，所有病例均是本院病理確診胃癌的病例，年齡47～71(60.26±9.71)歲，術(shù)前未經(jīng)過任何放化療治療，樣本取材后置于-80 ℃冰箱中保存所有病例均是本院病理確診胃癌的病例。本研究取得了本院倫理委員會的批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.3 細胞分組與轉(zhuǎn)染

細胞實驗所使用的胃癌細胞系MGC-803購自美國ATCC公司，細胞培養(yǎng)方式依照該公司說明書中所述。本實驗將MGC-803細胞分為NC組(轉(zhuǎn)染mimic NC)、miR-214-3p上調(diào)組(轉(zhuǎn)染miR-214-3p mimic)、miR-214-3p下調(diào)組(轉(zhuǎn)染miR-214-3p ASO，反義寡核苷酸(Antisense oligonucleotides, ASO)，PsiCHECK2 vector+mimic NC組、PsiCHECK2-p53 3′UTR+mimic NC組，PsiCHECK2 vector+miR-214-3p mimic組，PsiCHECK2-p53 3′UTR+miR-214-3p mimic組。miRNA轉(zhuǎn)染的操作按照說明書進行,，提前1 d將細胞種于6孔板中，當(dāng)細胞密度達到50%左右時，使用Lipofect 3000試劑進行轉(zhuǎn)染，36～48 h后進行后續(xù)細胞實驗。

1.4 細胞遷移與侵襲實驗

NC組、miR-214-3p下調(diào)組細胞轉(zhuǎn)染36 h后，進行細胞換液，用無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h；細胞遷移實驗，取細胞1×10個用300 μl無血清培養(yǎng)基稀釋后種于小室，并在小室下方的24孔板內(nèi)加入800 μl有血清培養(yǎng)基，置于細胞箱培養(yǎng)；細胞侵襲實驗，提前制作基質(zhì)膠60 μl并平鋪于小室底部，后續(xù)方法與前述細胞遷移實驗相同；待細胞遷移侵襲至小室外面，取出小室，PBS溶液清洗后，用乙醇進行細胞固定，結(jié)晶紫溶液染色，再次用PBS溶液清洗，用棉簽擦去小室內(nèi)面細胞，最后置于倒置相差顯微鏡上，并進行拍照計數(shù)。

1.5 miRNA靶基因預(yù)測

使用開放數(shù)據(jù)平臺ENCORI(http://starbase.sysu.edu.cn)和TargetScan(http://www.targetscan.org)預(yù)測miR-214-3p的下游靶基因。

1.6 熒光素酶報告實驗

將細胞種在24孔板中，待細胞貼壁生長后，分別將miR-214-3p mimic或mimic NC，Psicheck2-p53 3′UTR質(zhì)粒或Psicheck2-Vector對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進各組細胞，每組設(shè)置3個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染48 h后，使用螢光素酶報告實驗檢測試劑盒用熒光素讀取板進行上機檢測。

1.7 實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)

將抽提的NC組、miR-214-3p上調(diào)組、miR-214-3p下調(diào)組總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA模板，加入特異性引物，使用SYBR Green熒光定量PCR反應(yīng)試劑盒進行上機檢測，反應(yīng)結(jié)束后進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 miR-214-3p在胃癌組織中的表達

通過qPCR檢測miR-214-3p在41對胃癌組織及其對應(yīng)的癌旁正常組織中的表達水平。結(jié)果表明，癌旁正常組織miR-214-3p表達量為(6.834±3.212)，miR-214-3p在胃癌組織中的表達量為(22.107±7.215)；與癌旁正常組織相比，胃癌組織中miR-214-3p的表達上調(diào)(

P

<0.01，

t

=12.383，圖1)。

圖1 miR-214-3p在癌旁正常組織和胃癌組織中的表達情況 與癌旁正常組織比較：**P<0.01

2.2 miR-214-3p表達與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系

將胃癌miR-214-3p表達量的平均值設(shè)為標(biāo)準，大于平均值為高表達，小于等于平均值為低表達。通過分析miR-214-3p表達與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系顯示：miR-214-3p表達水平與胃癌患者的淋巴轉(zhuǎn)移具有顯著的正相關(guān)性(

P

<0.05)，而與其他特征性病理學(xué)參數(shù)包括病人患者的年齡、性別、分化程度、TNM分期、腫瘤大小均無顯著相關(guān)性(表1)。

表1 miR-214-3p表達與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 miR-214-3p可調(diào)節(jié)胃癌細胞的轉(zhuǎn)移能力

為了研究miR-214-3p對胃癌細胞轉(zhuǎn)移能力的影響，將miR-214-3p抑制劑miR-214-3p ASO和mimic NC分別轉(zhuǎn)染到MGC-803胃癌細胞系中。轉(zhuǎn)染36 h后，進行細胞遷移與侵襲實驗。結(jié)果表明，與NC組相比，miR-214-3p下調(diào)組細胞遷移和侵襲能力明顯降低(

P

<0.05，圖2)。

2.4 miR-214-3p在胃癌細胞中靶向調(diào)節(jié)p53的表達

使用開放數(shù)據(jù)平臺ENCORI和TargetScan預(yù)測miR-214-3p的靶基因，并發(fā)現(xiàn)了p53 mRNA的3′UTR與miR-214-3p匹配的潛在結(jié)合位點(圖3)。通過熒光素酶報告實驗，與PsiCHECK2 vector+miR-214-3p mimic組和PsiCHECK2-p53 3′UTR+mimic NC組相比，在胃癌細胞MGC-803中同時轉(zhuǎn)染miR-214-3p模擬物miR-214-3p mimic和p53 mRNA 3′UTR的Psicheck2質(zhì)粒的PsiCHECK2-p53 3′UTR+miR-214-3p mimic組，熒光素酶活性受到抑制(

P

<0.05，圖4)。同時，qPCR結(jié)果顯示，與NC組相比：轉(zhuǎn)染miR-214-3p mimic的上調(diào)組細胞，p53 mRNA的表達水平降低；而轉(zhuǎn)染了miR-214-3p ASO的下調(diào)組細胞，p53 mRNA的表達水平升高(

P

<0.05，圖5)。

3 討論

在人類大多數(shù)癌癥中均已報道異常的miRNA表達，而miRNA的異常表達通常與人類癌癥的惡性進展和不良預(yù)后具有高度相關(guān)性。眾多研究證明miRNA可促進或抑制不同的細胞過程，例如細胞凋亡、分化、發(fā)育、遷移和侵襲。

在本研究首先收集經(jīng)手術(shù)治療切除的41對胃癌及其對應(yīng)的癌旁新鮮組織樣本，通過qPCR檢測其中miR-214-3p的表達，結(jié)果顯示miR-214-3p在胃癌組織中的表達水平高于癌旁組織。Yang et al發(fā)現(xiàn)miR-214-3p在胃癌組織中上調(diào)，且miR-214-3p的上調(diào)與胃癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。Xin et al的研究結(jié)果也顯示，miR-214-3p可能通過下調(diào)PTEN來促進胃癌細胞的腹膜轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致胃癌的惡性進展。與之前的文獻結(jié)果一致，miR-214-3p已被證明在多種類型的癌癥的發(fā)生中起促進作用。

圖2 miR-214-3p調(diào)節(jié)胃癌細胞遷移和侵襲能力 ×200 與NC組比較：*P<0.05

圖3 miR-214-3p與p53 mRNA的3′UTR匹配結(jié)合位點

圖4 熒光素酶報告實驗檢測 胃癌細胞MGC-803中miR-214-3p對p53 mRNA 3′UTR的作用

圖5 qPCR檢測胃癌細胞MGC-803中轉(zhuǎn)染 miR-214-3p mimic或miR-214-3p ASO后 p53 mRNA的表達水平

本實驗通過在胃癌細胞MGC-803轉(zhuǎn)染miR-214-3p ASO，并進行細胞遷移與侵襲實驗，實驗結(jié)果顯示抑制miR-214-3p的表達可以降低胃癌細胞的轉(zhuǎn)移能力。這與Orso et al在乳腺癌中報道的相同，miR-214-3p上調(diào)導(dǎo)致乳腺癌和黑色素瘤細胞轉(zhuǎn)移能力的增強，從而最終促進癌癥的發(fā)展。但在不同的癌癥中，miR-214-3p對腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用可能是不同的。有文獻顯示miR-214-3p也可以起到抑癌的作用，Sun et al通過體外細胞實驗表明miR-214-3p可通過靶向BCL-9L來抑制結(jié)腸癌細胞的增殖，轉(zhuǎn)移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

本研究預(yù)測到p53 mRNA的3′UTR中存在一個保守的miR-214-3p結(jié)合位點。此外，熒光素酶報告實驗測定的結(jié)果表明，當(dāng)用PsiCHECK2-p53 3′UTR轉(zhuǎn)染細胞時，miR-214-3p mimic的過表達降低了熒光素酶的活性，而用PsiCHECK2-Vector轉(zhuǎn)染時則沒有降低熒光素酶的活性，該結(jié)果說明p53是miR-214-3p的直接靶標(biāo)。與該研究結(jié)果一致，Wang et al在骨髓瘤腫乳腺癌中發(fā)現(xiàn)p53是miR-214-3p的靶基因。p53作為一種著名的抑癌基因，在幾乎所有人類惡性腫瘤中產(chǎn)生突變或沉默，這成為腫瘤發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵因素。p53主要通過控制細胞周期、凋亡和DNA修復(fù)在維持基因組完整性方面的重要作用而聞名。最近，Kong et al報道lncRNA ZFPM2-AS1可以通過穩(wěn)定巨噬細胞遷移抑制因子來減弱p53途徑并促進胃癌發(fā)生。因此，為了研究胃癌細胞中miR-214-3p對p53的調(diào)控作用，本研究在胃癌細胞MGC-803中轉(zhuǎn)染miR-214-3p mimic和miR-214-3p ASO，通過qPCR結(jié)果分析顯示，過表達miR-214-3p可使p53 mRNA的表達水平降低，抑制miR-214-3p的表達可使p53 mRNA的表達水平增高。以上結(jié)果表明miR-214-3p的上調(diào)可以通過抑制p53的表達，從而增強胃癌細胞的遷移與侵襲能力。

綜上所述，本研究表明miR-214-3p在胃癌中的表達上調(diào)，提示miR-214-3p可以作為臨床胃癌的一個輔助診斷標(biāo)志物。miR-214-3p ASO可以抑制胃癌細胞的遷移與侵襲，因此，基于miR-214-3p的抑制劑可以被用作胃癌的潛在治療藥物。miR-214-3p靶向調(diào)控抑癌基因p53的表達，從而增強胃癌細胞的遷移與侵襲能力，進一步揭示了胃癌中miR-214-3p發(fā)揮促癌作用的機制。因此，這項研究為胃癌細胞的發(fā)病機制提供了新穎的見解，并提示miR-214-3p可作為胃癌治療的潛在治療靶標(biāo)。