髓源性生長因子促進血管生成能力的實驗研究

楊 振,文 志,江 石,龔文輝,葛圣林

血管生成不僅存在于生物體的正常生長發育全過程中，更參與了許多病理性疾病的進程以及修復過程。冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是冠狀動脈血管發生動脈粥樣硬化病變而引起血管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、低氧或壞死而導致的心臟病。對于部分病人保守治療效果不佳，又不適宜行血運重建的病人，以及術后部分再狹窄的病人尚無滿意的解決辦法。因此不少學者設想通過促進血管生成及增加冠脈的側枝循環來改善心肌的缺血性損傷，常見的促血管內皮細胞生長的因子包括血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)等。

骨髓源性生長因子(myeloid-derived growth factor，MYDGF)為19號染色體上開放閱讀框10編碼的一種蛋白，最近研究證實MYDGF不僅能促進內皮細胞生成，也能抑制心肌細胞的凋亡并改善心肌梗死后心肌細胞存活，保護、修復心肌梗死后的心臟。關于MYDGF對促進血管生成能力的研究報導較少，因此，探究MYDGF在血管形成中的作用，對于尋找冠心病有效的臨床治療靶點有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

種蛋 皖南三黃雞種蛋購于銅陵天健養殖場；人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)(武漢普諾賽生命科技有限公司)。

1.1.2

主要儀器和試劑

全自動種蛋孵化器(山東威振孵化設備公司)；MYDGF(上海近岸科技有限公司)；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)(上海碧云天生物技術有限公司)；迷你手鉆打孔器(山東美科工具有限公司);定性濾紙(南通邦杰曼濾紙公司)；移液槍(美國賽默飛世爾科技公司)；Matrigel基質膠(美國Corning公司)。

1.2 方法

1.2.1

MYDGF對雞胚絨毛尿囊膜

(

chick

chorioallantoic

membrane，CAM

)

血管新生影響 選擇1周之內產出、質量范圍在(50±10)g的新鮮皖南三黃雞種蛋 。用溫度為30 ℃左右的1‰新潔爾滅液擦洗消毒，將擦洗后的種蛋晾干后放入溫度37.5 ℃,相對濕度60%～70%的孵箱內孵育。將種蛋鈍頭朝上，使種蛋與蛋托約呈45°～60°夾角,為防止蛋胚黏連，每日早晚各翻轉種蛋1次。孵育至滿7 d時(滿 24 h 為1 d) ,照蛋等檢查種蛋孵育存活情況，并用記號表標記出雞胚氣室區域。成活雞胚可見CAM主要血管，未成活雞胚見不到CAM主要血管，棄取未成活雞胚。從中選擇成活雞胚用隨機數字表分組法將其分為5組，每組10枚雞胚，將5組分別命名為對照、PBS、低劑量MYDGF(10 ng/ml)、中劑量MYDGF(100 ng/ml)與高劑量MYDGF(500 ng/ml)組。用酒精棉球對各組雞胚進行消毒, 用迷你手工鉆在所標記出的雞胚氣室區域中央處鉆1小孔，用眼科鑷以此小孔為中心、向四周范圍逐漸輕柔剝取蛋殼，使開窗大小形狀約為(1.5×1.5)cm的類圓形。于開窗處滴加3滴無菌0.9%氯化鈉溶液，等待約1 min，使雞胚絨毛尿囊膜充分下陷以減少后續分離所形成的損傷，去除卵殼膜, 適當暴露出雞胚絨毛尿囊膜。提前選擇直徑為0.6 cm的手工打孔器，將定性濾紙打孔后進行高壓蒸汽滅菌，將滅菌后的直徑為0.6 cm的濾紙作為載體置于雞胚絨毛尿囊膜上，選擇尿囊膜血管區域相對較少區域處放置。用移液槍向載體上滴入30 μl藥物,用無菌PVDF膜封口,將操作后的雞胚封口處朝上放入孵育箱繼續孵育，每經過12 h揭去雞胚上的PVDF膜，向載體濾紙滴入相應的30 μl藥物，用新的無菌PVDF膜封口后繼續孵育。如此孵育2 d后，揭去PVDF膜 ,于載體上滴加2滴無菌生理鹽水便于后續分離，最大限度暴露CAM以便觀察拍照。向經拍照后的雞胚內注入甲醇與丙酮1 ∶1的混合固定液5 ml，室溫下固定20 min，待CAM上血管完全凝固后用眼科剪完整剪下CAM，將其放置于盛有蒸餾水的平皿中鋪展開來，用低倍顯微鏡觀察CAM上的血管生長情況，以載體為中心選擇大小形狀約(1×1) cm的圓形區域為計數圈，計數CAM上的血管與計數圈邊緣的交叉點記為血管數目(vascular number，VN)。將數碼相機所拍取的圖片(圖1A)用Image ProPlus 6.0軟件，根據光度與顏色等差異，對圖片進行處理(圖1B、C)。得出血管區域所占像素點個數記為VAi，得出圖片總像素點個數記為CAMi，將兩者比值記為VAi/CAMi，以此作為每張圖片上CAM的血管區域所占面積與CAM面積之比。由于Image ProPlus 6.0軟件是基于圖片顏色及明亮程度差異等選取血管區域，所以每次用選取圖片中血管所代表區域時會產生細微差別，所以，對每一張圖片進行3次測量，取其平均值作為VAi/CAMi的比值。

1.2.2

HUVEC的培養 顯微鏡下觀察HUVEC細胞形態呈鋪路石樣，24～36 h進行細胞換液，待其長至培養瓶單層的80%～90%時傳代。棄去舊培養基，無菌PBS溶液洗3遍，1 ml 0.25%胰酶消化液作用約2～3 min。顯微鏡下觀察，細胞變圓時，棄去消化液，用含10%胎牛血清的Ham′s F12培養液終止反應。用移液槍吹勻細胞1 ∶3進行傳代，于37 ℃、5%CO培養箱中培養。

1.2.3

CCK-8法檢測HUVEC增殖作用 取對數生長期HUVEC細胞，調整細胞密度，以2 000個/孔種植于96孔板中，分別設計對照組、MYDGF組(10 ng/ml、100 ng/ml)作用24 h，終止培養前每孔加入10 μl CCK-8試劑，輕微振蕩30 s混勻后放入培養箱中繼續培養1～4 h。于酶標儀中讀取450 nm處吸光度值。結果以5個復孔的均值表示。

1.2.4

檢測HUVEC的成管能力 4 ℃過夜融化matrigel膠，-20 ℃預冷24孔板和槍頭，在冰上以80 μl量的基質膠對24孔板鋪板，保證平鋪且沒有氣泡。將鋪好的24孔板放入細胞培養箱中培養1 h,待基質膠凝固。取生長狀態良好的對數生長期的HUVEC細胞，用濃度為0.25%胰酶消化后離心收集細胞，分別用無血清Ham′s F12培養基和用無血清Ham′s F12培養基所配濃度為100 ng/ml 的MYDGF混合液重懸細胞，重懸后將細胞濃度調至至2×10/ml。將細胞懸液沿孔壁加入鋪有基質膠的24孔板中，每孔500 μl。每組設置3個復孔。37 ℃、5%CO飽和濕度條件培養6 h；每隔2 h顯微鏡下觀察，100倍顯微鏡下拍照統計成管數目，每孔選擇3個視野拍照，用Image J軟件對分析處理，將3個視野計算所得平均值代表這個孔的相應數值。

2 結果

2.1 MYDGF對CAM血管生長影響

經數碼相機攝像后的圖片與經IPP 6.0軟件處理后的圖像中CAM血管對比，看出經IPP 6.0軟件處理后的圖片中血管顯示良好(圖1)。對照組、PBS組、低劑量MYDGF組CAM血管未見明顯差別，CAM血管發育良好，各級血管呈樹葉狀分布，但微血管數量不密集；中劑量MYDGF組與高劑量MYDGF組2組CAM血管發育良好，各級血管呈樹葉狀分布，血管清晰可見，較前面3組相比，可見二級分支血管及微血管數量增密(圖2)。

圖1 CAM原始圖像與處理后圖像血管顯示對比 ×4A：原始圖像；B：經Image Pro Plus中RGB處理后圖像；C：經灰度處理后的圖像

圖2 MYDGF對CAM血管生成的影響 ×4 A：對照組；B：PBS組；C：低劑量MYDFG組；D：中劑量MYDGF組；E：高劑量MYDGF組

2.2 CAM新生血管的定量觀察指標

與對照組CAM新生血管單位面積的VN、VA/CAM相比，用濃度100 ng/ml的MYDGF作用于CAM新生血管2 d后，CAM新生血管的VN、VA/CAM明顯增加，差異有統計學意義(

F

=25.815,

P

<0.01)。對照組、PBS組、低劑量MYDGF組3組中CAM新生血管條數VN及VA/CAM面積比值結果無明顯變化，差異均無統計學意義。用不同濃度MYDGF(濃度分別為10 ng/ml，100 ng/ml，500 ng/ml)作用于CAM新生血管2 d后，VN及VA/CAM面積比值變化顯示MYDGF對CAM新生血管呈現濃度依賴性(

F

=16.856,

P

<0.01)。見表1。

表1 各組VN與VA/CAM結果比較

2.3 MYDGF對HUVEC增殖功能的影響

與對照組比較，中劑量MYDGF組OD值增加，差異有統計學意義(

F

=25.51，

P

<0.05)，與對照組比較，低劑量MYDGF組OD值無明顯變化。見圖3。

圖3 MYDGF對HUVEC增殖的影響

2.4 MYDGF對HUVEC成管功能的影響

中劑量MYDGF組與對照組HUVEC成管圖像見圖4。與對照組成管的主干長度總計比較，低劑量MYDGF組組作用的HUVEC，其成管的主干長度總計明顯升高，差異有統計學意義(

F

=231.65，

P

<0.01)。與對照組成管的網格數比較，中劑量MYDGF組作用的HUVEC，其成管網格數目明顯升高，差異有統計學意義(

F

=268.13,

P

<0.01)。見圖5、6。

3 討論

冠心病主要由于動脈粥樣硬化，造成動脈血管堵塞、狹窄或者痙攣從而導致心肌低血低氧發生一系列病變的疾病。冠心病是致殘率及病死率極高的疾病，嚴重威脅著人類的健康與生命。數據顯示，中國心血管病患病率及病死率仍處于上升階段，中國心血管病患者已達2.9億例，其中冠心病患者約有1 100萬；心血管病病死率高居首位，占居民疾病死亡構成組成比40%以上，腫瘤及其他疾病，占居民疾病死亡構成的40%以上，其中45歲以下人群發病率呈逐年上升趨勢。因此，研究這一重大疾病的防治策略具有重大意義。應用藥物擴張冠狀動脈，使狹窄的心肌血管再生及建立有效的側枝循環，改善心肌缺血低氧目前已成為是藥物治療冠心病研究中的熱點之一。既往有研究表明，MYDGF能通過Akt及PI3K信號通路抑制小鼠心肌細胞凋亡，不止減少了小鼠心肌梗死區域的面積，還改善了小鼠的心室重構及心臟收縮功能。有多種組織和器官可以合成MYDGF，在急性心肌梗死患者的血漿及心肌梗死區域，MYDGF表達上調被認為是心肌損傷的適應保護機制。MYDGF還可通過STAT3、MAPK1/3信號通路和細胞周期蛋白D1的信號通路，以此增強內皮細胞的增殖。還有研究表明MYDGF能促進肝癌細胞增殖、對糖尿病腎病小鼠損失的足細胞有保護作用。該研究以CAM血管為模型，研究表明MYDGF可促進CAM新生血管的生成數目、CAM新生血管面積與CAM面積比值的增加，提示MYDGF能促進CAM新生血管生成能力，并呈現一定的濃度依賴性，而PBS對CAM新生血管的作用無明顯影響作用。MYDGF能促進HUVEC細胞OD增加，并增加其成管的主干長度及成管網格數目，提示MYDGF能提高HUVEC的增殖及成管能力。以上實驗提示MYDGF可促進血管生成，為MYDGF促進心肌血管狹窄后其側支循環血管的新生及狹窄部位血管再通的維持治療提供了新的實驗依據。

圖4 MYDGF對HUVEC成管能力的影響 ×100A：中劑量MYDGF組；B：對照組；1、2、3:隨機選取不同位置

圖5 MYDGF對HUVEC成管主干長度總計影響

圖6 MYDGF對HUVEC成管網格數影響

血管生成常用的研究模型方法有CAM法、人臍靜脈血管內皮細胞成管實驗法、血管內皮細胞模型法、鋸齒動物皮下氣囊、鋸齒動物虹膜和無血管的角膜等多種研究方法。CAM是雞胚的一層外膜，雞胚通過CAM進行氣體交換，同時CAM功能的發揮有賴于CAM中血管網的支撐，由于雞胚發育中大量尿囊膜血管生成，為研究血管生成提供的很好的實驗模型。而且雞胚發育早期，免疫系統尚發育不全，對測試藥物不會產生排斥反應，實驗結果易得且肉眼直觀可見。同時，該模型具有實驗材料易得、操作簡易、結果直觀、周期短等優點。

評價CAM血管常用的方法有人工計數血管數量、計數單位范圍內血管條數VN、計算血管平均直徑、計算CAM上的血管面積以及計算VA/CAM等。

本研究選擇人工計數單位范圍內血管條數VN及計算機軟件計算VA/CAM比值2種方法，使血管生成定量指標較為客觀且更符合肉眼觀察的實際情況。但由于CAM血管脆弱，即便小心操作，仍有一小部分CAM血管處破裂。而計算機軟件選擇CAM血管時，由于攝取圖片清晰度軟件自身功能影響，也會使處理后圖片中CAM血管于原始圖片存在少許誤差。因此，CAM血管生成定量研究方法有待于進一步完善。

促進血管生成是冠心病治療方法中的一個新領域，但因各類血管生成因子類制品在促進血管生成的同時，還潛在有著促使腫瘤、糖尿病性視網膜疾病等加速進展的可能。因此，MYDGF促進血管生成的具體作用機制尚有待進一步研究，MYDGF在臨床方面的應用及其潛在不良影響尚待進一步發現。對于缺血性疾病，MYDGF可能作用一種新的生長因子或新的潛在治療點。今后仍需要對MYDGF作用的受體或信號通路分子、MYDGF在心血管疾病中的作用及臨床應用等方面進行探索。