肝細(xì)胞內(nèi)相關(guān)mRNA抑制HBV復(fù)制與表達(dá)的功能驗(yàn)證

黃 鵬，邱 華，范春嬌，毛德文，李 旺，蒙蔭杰，何錦軼

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)為嗜肝DNA病毒，全世界大約有2.57億慢性HBV感染者。HBV持續(xù)感染不僅引起慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)，也會(huì)顯著增加肝硬化、肝衰竭及肝癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，抗病毒是HBV相關(guān)慢性肝病治療與防控的關(guān)鍵。干擾素和核苷(酸)類似物目前被認(rèn)為是兩類抗HBV藥物，但兩者均不能徹底清除共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)。前期臨床與實(shí)驗(yàn)研究表明，白花香蓮解毒顆粒在抗HBV方面具有較好的效果，但其抗HBV機(jī)制尚未完全明確。課題組根據(jù)前期mRNA芯片篩選結(jié)果及miRNA的靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果，選擇過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator activated receptorsα，PPARα)、核因子I/B(nuclear factor I/B，NFIB)和白細(xì)胞介素-8(interleukin-8，IL-8)代表白花香蓮解毒顆粒抑制HBV的靶mRNA進(jìn)行抗HBV的體外驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。該研究采用慢病毒基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，通過(guò)HepG2.2.15和HBV1.3P-HepG2細(xì)胞模型，驗(yàn)證PPARα、NFIB和IL-8 mRNA表達(dá)對(duì)HBV復(fù)制與表達(dá)的影響，為進(jìn)一步明確白花香蓮解毒顆粒抑制HBV復(fù)制與表達(dá)的機(jī)制及探尋HBV新的治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

HepG2細(xì)胞、HepG2.2.15細(xì)胞、293A細(xì)胞(上海諾百生物科技有限公司)，DH5α感受態(tài)細(xì)胞(上海唯地生物技術(shù)有限公司)；0.05% Trypsin、lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；DMEM購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；凝膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)Axygen公司；NheI/AscI內(nèi)切酶購(gòu)自加拿大Fermentas公司；胎牛血清、Opti-MEM 、MEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；包裝質(zhì)粒Packaging Mix購(gòu)自美國(guó)Biomics Biotech公司；SYBR Green PCR Master Mix 購(gòu)自美國(guó)Promega公司；Mouse Anti-HBsAg (H2F4)抗體、Anti-Mouse IgG H&L (PE/Cy5.5) preadsorbed購(gòu)自比利時(shí)Gentaur公司；HBsAg、HBeAg化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海東寰生物科技有限公司，批號(hào)：20181103；PCR引物合成及測(cè)序委托上海諾百生物科技有限公司完成。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)Rayto公司；BSL-Ⅱ級(jí)生物安全柜購(gòu)自山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；臺(tái)式冷凍離心機(jī)購(gòu)自力康生物醫(yī)療公司；熒光定量PCR儀購(gòu)自南京科信儀器儀表制造有限公司；CO培養(yǎng)箱購(gòu)自上海潤(rùn)度生物科技有限公司；熒光顯微鏡購(gòu)自意大利Sinico公司。

1.2 方法

1.2.1

mRNA慢病毒表達(dá)載體的制備

1.2.1.1 各基因CDS序列的擴(kuò)增 在NCBI網(wǎng)站查詢NFIB(NM_005596)、PPARα(NM_005036)和IL-8(NM_000584)序列，根據(jù)In-fusion技術(shù)設(shè)計(jì)上述基因的引物，并擴(kuò)增基因的CDS序列，引物序列如表1。用HepG2基因組作為模板，用表1引物將基因CDS序列擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增的序列插入慢病毒表達(dá)載體pL6.3-CMV-GFPa1-IRES-MCS中，獲得mRNA慢病毒質(zhì)粒表達(dá)載體。擴(kuò)增體系：10×PCR Buffer for KOD 5 μl、2 mmol/L dNTP 5 μl、25 mmol/L MgSO4 3 μl、引物F(10 mmol/L)1.5 μl、引物R(10 mmol/L)1.5 μl、模板1 ng、KOD 2.5 units，加水至50 μl；PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃、2 min，94 ℃、15 s，60 ℃、30 s，68 ℃、1 kb/min，30個(gè)循環(huán)，68 ℃、10 min。

表1 基因CDS序列擴(kuò)增引物

1.2.1.2 慢病毒表達(dá)載體酶切及In-fusion連接 將pL6.3-CMV-GFPa1-IRES-MCS載體通過(guò)NheI/AscI雙酶切，酶切體系：1×Buffer 5 μl、5 μg/50 μl質(zhì)粒1 μg、NheI 2 μl、AscI 2 μl，加ddHO至50 μl。酶切產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，得到線性化pL6.3-CMV-GFPa1-IRES-MCS載體。pL6.3-CMV-GFPa1-IRES-MCS線性化載體和HBV DNA-1.3P通過(guò)Infusion連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，連接體系：5×CE II Buffer 4 μl、pL6.3-CMV-GFPa1-IRES-MCS線性化載體50～200 ng、HBV DNA-1.3P 20～200 ng、Exnase? II 2 μl，加ddHO至20 μl混勻。選擇轉(zhuǎn)化的克隆進(jìn)行PCR鑒定，陽(yáng)性克隆委托測(cè)序公司測(cè)序鑒定。

1.2.2

mRNA慢病毒包裝及滴度測(cè)定 293A細(xì)胞經(jīng)0.05% Trypsin消化并鋪在10 cm培養(yǎng)皿中，細(xì)胞數(shù)為6×10個(gè)/皿，培養(yǎng)過(guò)夜。轉(zhuǎn)染前，將培養(yǎng)皿內(nèi)完全培養(yǎng)液換成5 ml Opti-MEM培養(yǎng)液。在5 ml EP管中加入1.5 ml Opti-MEM、9 μg Packaging Mix和3 μg慢病毒表達(dá)質(zhì)粒，混勻；在另一5 ml EP管中加入1.5 ml Opti-MEM和36 μl lipofectamine 2000混勻。把質(zhì)粒和lipofectamine 2000稀釋液混勻20 min后，再將質(zhì)粒脂質(zhì)體復(fù)合物加入到培養(yǎng)皿中充分混勻，培養(yǎng)4～6 h后換培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h離心后收集上清液，過(guò)濾，獲得慢病毒原液。使用熒光法測(cè)定病毒活性滴度。

1.2.3

HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞MOI測(cè)定 293T細(xì)胞用胰酶消化后制成懸液，計(jì)算所需病毒液體積，每個(gè)感染復(fù)數(shù) (multiplication of infection, MOI)梯度設(shè)加8%聚凝胺組和不加8%聚凝胺組，將所需的病毒液加至靶細(xì)胞中，對(duì)照為慢病毒侵染293A細(xì)胞，MOI值=1，加8%聚凝胺，放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 、72 h后，觀察細(xì)胞存活狀態(tài)和侵染后陽(yáng)性細(xì)胞比例并拍照。

1.2.4

HepG2和HepG2.2.15慢病毒侵染及轉(zhuǎn)染 病毒侵染前一天將靶細(xì)胞接種至96孔板(第2天細(xì)胞密度以60%～70%為宜)。將病毒液冰上融解后，根據(jù)測(cè)定的MOI值用含2%FBS的MEM培養(yǎng)基稀釋，加8 μg/ml的Polybrene，混勻后將配置好的病毒液加入細(xì)胞中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h后換液，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和熒光蛋白表達(dá)情況并拍照。把293A細(xì)胞接種于12孔板中培養(yǎng)，去除原來(lái)的培養(yǎng)液，換為opti-MEM，接著配置DNA或RNA與脂質(zhì)體的復(fù)合物，將其加到細(xì)胞中孵育4～6 h后換液繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后觀察轉(zhuǎn)染情況。

1.2.5

qPCR檢測(cè)HBV

DNA復(fù)制及結(jié)果分析 收集各組細(xì)胞，抽提總DNA。HBV DNA的檢測(cè)引物(上游引物：CTCGTGGTGGACTTCTCTC，下游引物： CAGCAGGATGAAGAGGAA)；以18 S rDNA為內(nèi)參，擴(kuò)增引物為引物18S-F(序列：GAATTGACGGAAGGGCACCAC)和18S-R(序列：AAGAACGGCCATGCACCACCA)?；虮稊?shù)關(guān)系以R=2表示 。參考前期反應(yīng)體系：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μl、引物F 1 μl、引物R 1 μl、模板 1 μl、RNase-free HO 5 μl；PCR反應(yīng)條件：95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。

1.2.6

化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)細(xì)胞上清液中HBsAg和HBeAg表達(dá)量 參照前期實(shí)驗(yàn)方法，收集細(xì)胞上清液，測(cè)定HBsAg和HBeAg表達(dá)量，檢測(cè)方法根據(jù)HBsAg、HBeAg試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.7

免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HBsAg表達(dá)量 參照前期實(shí)驗(yàn)方法，將細(xì)胞爬片，0.25%TRITON X-100/PBS孵育5 min，使細(xì)胞通透，用10%BSA/PBS，37 ℃下孵育30 min，再用3%BSA/PBS稀釋濃度為1 ∶100的Mouse Anti-HBsAg (H2F4)抗體，37 ℃下孵育2 h，3%BSA/PBS稀釋濃度為1 ∶200的Anti-Mouse IgG H&L (PE/Cy5.5) preadsorbed，37 ℃下避光孵育45 min，熒光顯微鏡觀察并拍照，將照片用Image-Pro Plus軟件計(jì)算平均吸光度和分析熒光的強(qiáng)弱。

2 結(jié)果

2.1 mRNA慢病毒表達(dá)載體的制備

以HepG2基因組為模板擴(kuò)增PPARα、NFIB和IL-8 mRNA的CDS序列，然后將該序列插入慢病毒表達(dá)載體pL6.3-CMV-GFPa1-IRES-MCS中，并對(duì)這些載體進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，獲得構(gòu)建正確的pL6.3-CMV-GFPa1-IRES-NFIB、pL6.3-CMV-GFPa1-IRES-PPARα和pL6.3-CMV-GFPa1-IRES-IL-8載體，見(jiàn)圖1。

圖1 pL6.3-CMV-GFPa1-IRES-NFIB、pL6.3-CMV-GFPa1-IRES-PPARα 和pL6.3-CMV-GFPa1-IRES-IL-8載體的測(cè)序圖譜

圖2 慢病毒滴度測(cè)定熒光圖 ×100

2.2 mRNA表達(dá)慢病毒包裝

將pL6.3-CMV-GFPa1-IRES-NFIB、pL6.3-CMV-GFPa1-IRES-PPARα和pL6.3-CMV-GFPa1-IRES-IL-8質(zhì)粒分別和PSPAX2、PMD2G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞后包裝病毒，收集病毒液，濃縮。采用熒光法測(cè)定慢病毒滴度，實(shí)驗(yàn)分別用0.4 μl慢病毒液侵染1×10個(gè)細(xì)胞，pL6.3-CMV-GFPa1-IRES-NFIB感染細(xì)胞比例達(dá)到60%，其滴度為1×10×60%×10/0.4=1.5×10TU/ml；pL6.3-CMV-GFPa1-IRES-PPARα和pL6.3-CMV-GFPa1-IRES-IL-8病毒液感染細(xì)胞比例達(dá)到40%，其滴度為1×10TU/ml。見(jiàn)圖2。

2.3 HepG2.2.15、HBV1.3P-HepG2細(xì)胞內(nèi)各組mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

將PPARα、NFIB及IL-8基因分別轉(zhuǎn)入HepG2.2.15、HBV1.3P-HepG2細(xì)胞中，將NC作為對(duì)照組，轉(zhuǎn)染48 h收集細(xì)胞沉淀。秩和檢驗(yàn)結(jié)果顯示，在以上2種不同細(xì)胞中，NC組與PPARα組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)；NC組與NFIB組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

P

<0.05)；NC組與IL-8組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

P

<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 HepG2.2.15、HBV1.3P-HepG2細(xì)胞內(nèi) 各組mRNA相對(duì)表達(dá)量的秩和檢驗(yàn)(n=6)

2.4 HepG2.2.15、HBV1.3P-HepG2細(xì)胞內(nèi)各組HBV DNA相對(duì)表達(dá)量的比較

PPARα分別轉(zhuǎn)染HepG2.2.15、HBV1.3P-HepG2細(xì)胞后能促進(jìn)HBV DNA的復(fù)制，其表達(dá)程度分別是NC組的1.46倍和1.27倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)；NFIB分別轉(zhuǎn)染HepG2.2.15、HBV1.3P-HepG2細(xì)胞后可以抑制HBV DNA的復(fù)制，其表達(dá)程度分別是NC組的0.76倍和0.55倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05、

P

<0.001)；IL-8分別轉(zhuǎn)染HepG2.2.15、HBV1.3P-HepG2細(xì)胞后可以促進(jìn)HBV DNA的復(fù)制，其表達(dá)程度分別是NC組的1.54倍和1.62倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05、

P

<0.001)。見(jiàn)表3。

2.5 HepG2.2.15、HBV1.3P-HepG2細(xì)胞上清液中各組HBsAg、HBeAg表達(dá)量的比較

與NC組比較，在HepG2.2.15、HBV1.3P-HepG2細(xì)胞上清液中，NFIB轉(zhuǎn)染后可以下調(diào)HBsAg和HBeAg表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.001、

P

<0.05)；在HepG2.2.15、HBV1.3P-HepG2細(xì)胞上清液中，PPARα和IL-8轉(zhuǎn)染后可以上調(diào)HBsAg和HBeAg表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

P

<0.05)。見(jiàn)表4、5。

表3 HepG2.2.15、HBV1.3P-HepG2細(xì)胞內(nèi)各組HBV DNA 相對(duì)表達(dá)量比較

表4 HepG2.2.15、HBV1.3P-HepG2細(xì)胞上清液中 各組HBsAg表達(dá)量比較

表5 HepG2.2.15、HBV1.3P-HepG2細(xì)胞上清液中 各組HBeAg表達(dá)量比較

2.6 免疫熒光檢測(cè)mRNA在HepG2.2.15、HBV1.3P-HepG2細(xì)胞內(nèi)對(duì)HBsAg表達(dá)的影響

與NC組比較，NFIB轉(zhuǎn)染HepG2.2.15、HBV1.3P-HepG2細(xì)胞后HBsAg表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)；PPARα和IL-8轉(zhuǎn)染HepG2.2.15、HBV1.3P-HepG2細(xì)胞后HBsAg表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。見(jiàn)表6，圖3、4。

3 討論

HBV是用超螺旋結(jié)構(gòu)cccDNA把其基因組物質(zhì)儲(chǔ)存起來(lái)，在細(xì)胞核內(nèi)能夠持久存在，而且宿主免疫應(yīng)答不能干擾它。干擾素和核苷(酸)類似物這兩大抗病毒藥都不能干預(yù)到cccDNA，這成為HBV感染很難治愈的關(guān)鍵因素。宿主與病毒通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的相互競(jìng)爭(zhēng)，使得其抗病毒機(jī)理變得復(fù)雜。因此，在研究HBV與宿主之間關(guān)系的同時(shí)，尤其需要關(guān)注和有必要從宿主肝細(xì)胞內(nèi)探尋藥物治療的新靶點(diǎn)。

表6 免疫熒光檢測(cè)mRNA在HepG2.2.15、HBV1.3P-HepG2 細(xì)胞內(nèi)對(duì)HBsAg表達(dá)的影響

圖3 免疫熒光檢測(cè)mRNA在 HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)對(duì)HBsAg表達(dá)的影響 ×100

圖4 免疫熒光檢測(cè)mRNA在HBV1.3P-HepG2細(xì)胞內(nèi) 對(duì)HBsAg表達(dá)的影響 ×100

mRNA是由DNA的一條鏈作為模板轉(zhuǎn)錄而來(lái)的，攜帶遺傳信息且能指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的一類單鏈核糖核酸。越來(lái)越多的研究表明，mRNA在HBV復(fù)制中扮演著重要的角色。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs)根據(jù)功能不同，將其分為PPARα、PPARβ/δ和PPARγ3種亞型。研究表明PPARα反義序列PPARα-2能夠使細(xì)胞中的PPARα mRNA和蛋白水平降低，隨著劑量的增加，抑制肝癌細(xì)胞中HBsAg和HBeAg的水平越明顯。Chen et al報(bào)道m(xù)iR-141-3p能通過(guò)靶向PPARα mRNA，將HBV啟動(dòng)子的活性減少，從而抑制HBV復(fù)制。

NFIB屬于核因子-I(nuclear factor-I，NF-I)家族，NFIB是其成員之一，參與各種細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄和調(diào)控。HBV基因組中有3個(gè)NF-I結(jié)合位點(diǎn)可以被識(shí)別出來(lái)，且各自發(fā)揮著不同的功能。許多細(xì)胞與HBV基因啟動(dòng)子含有NF-1的結(jié)合點(diǎn)，表明HBV基因啟動(dòng)子的有效活化需要NF-1的參與，缺失部分或整個(gè)NF-1結(jié)合點(diǎn)導(dǎo)致HBVS基因的轉(zhuǎn)錄降低5～10倍。Guo et al發(fā)現(xiàn)NFIB對(duì)HBV增強(qiáng)子和核心啟動(dòng)子(ENⅠ-Cp)具有抑制作用，同時(shí)還能降低HBsAg和HBeAg的表達(dá)，miR372可以與NFIB相結(jié)合，從而阻止NFIB抑制HBV復(fù)制的作用。

IL-8是肝細(xì)胞內(nèi)重要的炎癥趨化因子，迄今為止尚不清楚IL-8在HBV致病過(guò)程中的作用。穆玄玄 等報(bào)道HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭患者肝組織及外周血IL-8水平顯著升高，且血清IL-8水平與患者肝臟炎癥損傷和病情嚴(yán)重程度有關(guān)。近年來(lái)研究表明，在HBV感染早期階段，IL-8可以促進(jìn)HBV復(fù)制，IL-8過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生許多HBV轉(zhuǎn)錄因子，可以促進(jìn)CHB患者發(fā)生慢性化和重癥化的風(fēng)險(xiǎn)。

本研究通過(guò)慢病毒將PPARα、NFIB及IL-8轉(zhuǎn)入HepG2.2.15和HBV1.3P-HepG2細(xì)胞模型中，秩和檢驗(yàn)結(jié)果顯示，在以上2種不同細(xì)胞中，NC組與PPARα組、NFIB組、IL-8組兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明PPARα、NFIB及IL-8在上述細(xì)胞模型中能夠正常表達(dá)。mRNA干預(yù)HBV功能驗(yàn)證顯示，PPARα、IL-8能夠增加HBV DNA表達(dá)量及上調(diào)HBsAg、HBeAg表達(dá)水平，而NFIB能夠減少HBV DNA表達(dá)量及下調(diào)HBsAg、HBeAg表達(dá)水平。隨后采用免疫熒光檢測(cè)mRNA在2個(gè)細(xì)胞模型內(nèi)對(duì)HBsAg表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，NFIB轉(zhuǎn)染HBV1.3P-HepG2后HBsAg表達(dá)下降，PPARα和IL-8轉(zhuǎn)染后HBsAg表達(dá)上調(diào)。本研究在細(xì)胞模型內(nèi)外同時(shí)做了驗(yàn)證，因此得出結(jié)論，肝細(xì)胞內(nèi)PPARα和IL-8是一種促進(jìn)HBV復(fù)制的mRNA，而NFIB是一種抑制HBV復(fù)制的mRNA，這與吳小桃 等、Guo et al、穆玄玄 等的研究結(jié)果有相似之處。與上述研究不同的是，本實(shí)驗(yàn)在HepG2.2.15細(xì)胞中驗(yàn)證的同時(shí)，選擇前期成功構(gòu)建的HBV1.3P-HepG2模型進(jìn)行驗(yàn)證，該模型不僅能夠穩(wěn)定表達(dá)HBV標(biāo)志物，而且HBV1.3P能反映病毒株的自身復(fù)制情況，有利于研究HBV復(fù)制與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的全過(guò)程。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)利用慢病毒基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，觀察到轉(zhuǎn)染后的mRNA在HepG2.2.15和HBV1.3P-HepG2細(xì)胞模型中，其中PPARα、IL-8能夠促進(jìn)HBV復(fù)制，而NFIB可以抑制HBV復(fù)制，但它們通過(guò)何種途徑促進(jìn)或抑制HBV復(fù)制，其機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。NFIB可能成為治療HBV的新型藥物作用靶點(diǎn)，有待在動(dòng)物模型上進(jìn)一步驗(yàn)證其抑制HBV的療效。本研究顯示，在HepG2.2.15、HBV1.3P-HepG2細(xì)胞模型中過(guò)表達(dá)IL-8能夠提高HBV復(fù)制水平。該研究結(jié)果可能有助于更好地認(rèn)識(shí)肝臟炎癥與HBV DNA載量之間的辨證關(guān)系，明確中醫(yī)藥(包括壯醫(yī)藥)在抗HBV領(lǐng)域的定位與價(jià)值，實(shí)現(xiàn)中醫(yī)藥抗HBV治療的新突破。