鹽酸青藤堿通過C/EBPβ-COX-2通路抑制LPA誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞增殖

王 新，盧朝輝，李雅睿，郭 丹，張 旭，曹 琰，李皓瑞，和水祥，盧新蘭

由于非酒精性脂肪肝及其相關(guān)性肝癌患病人數(shù)逐年增加，其致癌機(jī)制是目前的研究熱點。溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA)是一種脂代謝中的磷脂分子，具有類生長因子的生物活性，可能是肝臟炎癥、脂代謝紊亂與肝癌發(fā)生之間重要的橋梁分子。環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)是前列腺素合成限速酶，在肝癌等多種癌組織中過表達(dá)。在卵巢癌中，LPA可通過轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β(C/EBPβ)誘導(dǎo)COX-2高表達(dá)。多種抗炎藥同時具有抗腫瘤活性。青藤堿是從中藥青風(fēng)藤中提取出的生物堿單體，鹽酸青藤堿(sinomenine hydrochloride，SIN)是水溶性鹽酸鹽，具有抗炎、抗免疫藥理作用，臨床上用于治療關(guān)節(jié)炎，課題組前期研究已證實其抗肝癌活性。目前在肝癌中LPA與COX-2關(guān)系如何及SIN是否調(diào)控LPA相關(guān)信號通路尚不清楚。該研究探討LPA能否誘導(dǎo)人肝癌Huh7細(xì)胞COX-2表達(dá)、增殖及其可能機(jī)制，并驗證SIN對其可能的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系與試劑

人肝癌Huh7細(xì)胞由西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科研究所凍存保種。SIN(純度>98%)購自上海abcam公司；MTT、DMSO、LPA(純度>98%)購自上海Sigma-Aldrich公司，其中LPA用PBS溶解成母液，由無血清細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成工作液；DMEM培養(yǎng)液購自美國Gbico公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；小鼠抗人C/EBPβ、COX-2、GAPDH單抗均購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購自北京中杉金橋生物公司；Fast 200總RNA極速抽提試劑盒購自上海飛捷生物公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq Real-time PCR試劑盒購自大連寶生物公司。

1.2 方法

1.2.1

細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌Huh7細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)采用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 U/ml鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)于5% CO、濕度95%、37 ℃的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。待細(xì)胞生長到鋪滿細(xì)胞培養(yǎng)皿底面80%左右進(jìn)行傳代。細(xì)胞在用LPA處理前用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。

1.2.2

Real

-

time

PCR測定mRNA表達(dá)水平

采用Fast 200總RNA極速抽提試劑盒提取不同處理組Huh7細(xì)胞總RNA，定量后按0.4 μg上樣量逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。定量逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物調(diào)整后濃度為0.2 g/L，上樣量為200 ng，按照說明書進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。GAPDH為內(nèi)參對CHOP mRNA的表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。反應(yīng)體系(20 μl)：10 μl SYBR，0.2 μg模板cDNA，正反向引物濃度均為20 μmol/L，體積為0.8 μl，使用滅菌蒸餾水使總體積達(dá)20 μl。PCR過程：40個循環(huán)、94 ℃、1 min；54 ℃、1 min；聚合72 ℃、1 min；延伸72 ℃、7 min。mRNA的相對表達(dá)倍數(shù)使用公式2計算。根據(jù)NCBI官網(wǎng)提供的人基因信息，按照引物設(shè)計原則設(shè)計人C/EBPβ、COX-2和GAPDH基因引物序列。C/EBPβ正向引物：5′-TTCCTCTCCGACCTCTTCTC-3′，反向引物：5′-CCAGACTCACGTAGCCGTACT-3′；COX-2正向引物：5′-AAGTCCCTGAGCATCTACG-3′，反向引物：5′-TTCCTACCACCAGCAACC-3′；GAPDH正向引物：5′-ATGGGGAAGGTGAAGGTCGG-3′，反向引物：5′-GACGGTGCCATGGAATTTGC-3′。

1.2.3

Western

blot測定蛋白表達(dá)水平

Huh7細(xì)胞給予不同處理后，加入RIPA全蛋白裂解液(含Cocktail和PMSF)提取細(xì)胞總蛋白。用Bradford法測定裂解產(chǎn)物的蛋白濃度。30 μg的蛋白樣品上樣至120 g/L的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離蛋白，隨后將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。在室溫下用5%的脫脂牛奶封閉1 h，然后加入適量一抗稀釋液在4 ℃下孵育過夜，TBST緩沖液洗膜后加入適量二抗稀釋液在室溫條件下孵育1 h。采用ECL檢測系統(tǒng)進(jìn)行顯色、曝光、沖洗X膠片，使用掃描儀進(jìn)行掃描。

1.2.4

MTT法檢測細(xì)胞增殖

人肝癌Huh7細(xì)胞經(jīng)消化、離心后，以6 000個/孔接種于96孔板，培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后，換成無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，將細(xì)胞分為：對照組(無血清培養(yǎng)液)、LPA組(10 μmol/L)、SIN+LPA組。SIN+LPA組中細(xì)胞先加入SIN(100、400 μmol/L)預(yù)處理1 h，隨后加入10 μmol/L LPA。上述各組細(xì)胞處理后培養(yǎng)24 h后，原培養(yǎng)液被吸除后加入MTT工作液(0.5 g/L)200 μl，繼續(xù)孵育4 h后將MTT工作液吸除，在每孔中加入DMSO(150 μl)后于振蕩器上振蕩10 min，將酶標(biāo)儀吸收波長設(shè)定為490 nm，測出每孔的相對吸光度(optical density, OD)值。相對細(xì)胞活力(%)=處理組OD值/對照組OD值×100%。

2 結(jié)果

2.1 LPA時間依賴性誘導(dǎo)人肝癌Huh7細(xì)胞C/EBPβ和COX-2表達(dá)

無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，用10 μmol/L LPA處理人肝癌Huh7細(xì)胞0、0.5、1、2、4、6 h。收集細(xì)胞總蛋白后，通過Western blot顯示LPA能夠時間依賴性上調(diào)Huh7細(xì)胞的C/EBPβ和COX-2蛋白表達(dá)水平，其中LPA處理6 h后變化最為顯著(圖1A)。用10 μmol/L的LPA處理細(xì)胞2、6 h，提取細(xì)胞總RNA后通過Real-time PCR檢測顯示，LPA能夠時間依賴性上調(diào)C/EBPβ和COX-2的mRNA表達(dá)水平(圖1B)。

圖1 LPA時間依賴性上調(diào)人肝癌Huh7細(xì)胞的C/EBPβ和COX-2表達(dá)

2.2 LPA濃度依賴性誘導(dǎo)人肝癌Huh7細(xì)胞C/EBPβ和COX-2表達(dá)

LPA處理組為各濃度LPA(0、0.5、1、5、10 μmol/L)分別處理細(xì)胞6 h，收集細(xì)胞總蛋白后，通過Western blot顯示LPA能夠濃度依賴性上調(diào)人肝癌Huh7細(xì)胞C/EBPβ和COX-2蛋白表達(dá)水平，其中10 μmol/L LPA濃度組變化最為顯著(圖2A)。用1、10 μmol/L的LPA分別處理細(xì)胞6 h，提取細(xì)胞總RNA并通過Real-time PCR技術(shù)檢測顯示，LPA能夠濃度依賴性上調(diào)C/EBPβ和COX-2的mRNA表達(dá)水平(圖2B)。

2.3 SIN通過下調(diào)C/EBPβ、COX-2表達(dá)抑制LPA所誘導(dǎo)的人肝癌Huh7細(xì)胞增殖

SIN+LPA組細(xì)胞中加入不同濃度(100、200、400、800 μmol/L)SIN預(yù)處理1 h后加入10 μmol/L LPA，LPA組中僅加入10 μmol/L LPA，對照組中加入無血清培養(yǎng)液，6 h后收集各組細(xì)胞總蛋白。通過Western blot顯示SIN能夠濃度依賴性下調(diào)LPA所誘導(dǎo)的Huh7細(xì)胞中C/EBPβ和COX-2蛋白表達(dá)水平(圖3A)。用200、400 μmol/L的SIN分別預(yù)處理細(xì)胞1 h后加入10 μmol/L的LPA，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后提取細(xì)胞總RNA并行Real-time PCR檢測C/EBPβ和COX-2 mRNA表達(dá)水平，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后行MTT檢測細(xì)胞增殖。如圖3B、C中所示，SIN濃度依賴性抑制LPA所誘導(dǎo)的人肝癌Huh7細(xì)胞C/EBPβ、COX-2 mRNA表達(dá)和增殖。

圖2 LPA濃度依賴性上調(diào)人肝癌Huh7細(xì)胞的C/EBPβ和COX-2表達(dá)

3 討論

自分泌運(yùn)動因子(autotaxin, ATX)是能將底物溶血磷脂酰膽堿催化成為LPA的酶。ATX/LPA信號軸分泌及表達(dá)增加是多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要步驟之一。研究表明，肝纖維化患者血中ATX和LPA水平升高，與丙肝、肝硬化的分期和并發(fā)癥相關(guān)；肝癌患者血清LPA水平升高與腫瘤負(fù)荷相關(guān)。一些促炎細(xì)胞因子如TNF-α能夠激活A(yù)TX/LPA信號通路，進(jìn)而促進(jìn)炎癥相關(guān)的肝癌發(fā)生。此外，LPA激活p38絲裂原活化蛋白激酶和Rho/p160ROCK信號通路信號通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞粘附、遷移和侵襲。一項關(guān)于肝癌中基質(zhì)/腫瘤相互作用的研究表明，LPA由肝癌細(xì)胞旁分泌并促進(jìn)成對瘤周組織成纖維細(xì)胞向癌相關(guān)成纖維細(xì)胞樣表型的轉(zhuǎn)化，從而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。總之，LPA直接參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展。

圖3 SIN濃度依賴性抑制LPA所上調(diào)的人肝癌Huh7細(xì)胞C/EBPβ、COX-2表達(dá)和增殖

COX-2可被包括LPA在內(nèi)的多種生長因子、炎癥因子誘導(dǎo)表達(dá)，其在肝癌組織中高表達(dá)，與肝癌的發(fā)生、發(fā)展和治療效果密切相關(guān)。本研究證實LPA能夠時間及濃度依賴性誘導(dǎo)人肝癌Huh7細(xì)胞COX-2的轉(zhuǎn)錄及翻譯水平升高。COX-2基因的表達(dá)可被諸多轉(zhuǎn)錄因子如C/EBPβ調(diào)控，因其啟動子區(qū)有這些轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點。C/EBPβ屬于C/EBP轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，在其mRNA上有多個的開放讀碼框(ORF)和AUG起始密碼子位點，能夠翻譯出3種不同的蛋白亞型，分別為38 ku的LAP*、35 ku的LAP以及20 ku的LIP。其中，2個LAP因同時含有N末端轉(zhuǎn)錄活性結(jié)構(gòu)域、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和C末端bZIP結(jié)構(gòu)域而屬于轉(zhuǎn)錄激活因子；LIP只含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和bZIP結(jié)構(gòu)域而缺乏轉(zhuǎn)錄活性結(jié)構(gòu)域，屬于轉(zhuǎn)錄抑制因子，不具備轉(zhuǎn)錄活性。本研究顯示，LPA能夠時間-濃度依賴性升高人肝癌Huh7細(xì)胞C/EBPβ的mRNA轉(zhuǎn)錄和其2個LAP蛋白亞型的水平，進(jìn)而上調(diào)COX-2表達(dá)、促進(jìn)細(xì)胞增殖。有研究報道抗炎藥物SIN能夠通過抑制軟骨細(xì)胞的炎癥相關(guān)因子COX-2、iNOS、TNF-α和IL-6表達(dá)改善小鼠骨關(guān)節(jié)炎。本研究表明,SIN能夠抑制人肝癌Huh7細(xì)胞中LPA所誘導(dǎo)的C/EBPβ、COX-2表達(dá)和細(xì)胞增殖。