TET對舌鱗癌細胞SCC9生長、運動和裸鼠體內成瘤的影響及機制研究

牛 兵，王國芳，李坤陽，丁 虹，劉愛群

舌鱗癌是人類最常見的頭頸部惡性腫瘤之一，研究表明舌鱗癌約占全部口腔惡性腫瘤的30%。相比其他口腔惡性腫瘤，由于舌部血供豐富，淋巴引流廣泛，舌鱗癌患者往往會出現淋巴結侵潤與轉移等現象，同時舌鱗癌具有局部侵襲性、轉移性、復發率高、愈后較差等特點。尋找舌癌有效治療方法十分迫切。漢防己甲素(tetrandrine，TET)是一種從中草藥防己科植物粉防己的塊根中提取的雙芐基異喹啉類生物堿。目前臨床上主要用于風濕性疼痛、關節炎、神經痛、矽肺等疾病的治療。近年來，TET在腫瘤治療中的效果得到了一步得到證實，TET對肝癌、膀胱癌、肺癌、結腸癌等癌細胞的增殖、侵襲及遷移有一定的影響。該文通過研究TET對舌鱗癌細胞SCC9生長、運動和裸鼠體內成瘤的影響，以期了解TET對舌鱗癌細胞SCC9生長、運動和裸鼠體內成瘤的影響及作用機制，從而為舌鱗癌患者治療提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

舌鱗癌SCC9細胞購自中國科學院細胞庫。裸鼠60只，體質量 (15±2)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號SCXK(京)2017-0022，普通級，分12個籠子飼養，5只/籠，飼養于鄭州大學動物中心實驗室，飼養溫度20～25 ℃，相對濕度50%～65%，該實驗經過動物倫理委員會批準同意。TET(貨號：B10395-100；純度>98%)購自上海士鋒生物科技有限公司；Ki67、Caspase-3抗體購自上海艾博抗有限公司；血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial cell growth factor，VEGF)抗體購自美國Sino Biolocgical公司；磷酯酰肌醇-3 激酶( phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)、p-PI3K、AKT、p-AKT抗體購自美國Sigma公司；mTOR、p-mTOR抗體購自上海Santa Cruze Biotechnology 公司；磷酸緩沖液PBS購自天津科密歐有限公司；4-硝基喹啉-1-氧化物購自美國Sigma 公司。低溫離心機購自湖南恒諾離心機有限公司；光學顯微鏡購自東莞市同創儀器有限公司；熒光分光光度計購自上海儀電分析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1

分組干預

將舌鱗癌SCC9細胞分為：空白對照組、低劑量TET組、中劑量TET組、高劑量TET組，分別使用0、2.5、5、10 μmol/L 的TET預處理。

將60只裸鼠分為：空白對照組、低劑量TET組、中劑量TET組、高劑量TET組，每組各15只，分別口服灌胃TET 0、12.5、25、50 mg/(kg·d)。

1.2.2

細胞培養

將舌鱗癌SCC9細胞培養于含10% FBS、100 U/ml 青霉素和100 U/ml鏈霉素RPMI1640 培養基中，保存在溫度為37 ℃、5%CO的培養箱內培養，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.3

建立模型

建立舌鱗癌動物模型及判斷建模是否成功參考蔣燦華 等實驗方法。采用0.002% 4- 硝基喹啉- 1- 氧化物自然飲水喂養36周，誘發建立舌鱗癌動物模型，造模中途有裸鼠死亡立即補上。

1.2.4

克隆形成實驗檢測細胞生長

取對數生長期細胞，制作1×10/ml單細胞懸液并計數，并將細胞種到6孔板中分細胞梯度培養，2周后微鏡下可見明顯克隆形成，結晶紫染色后拍照，并計算克隆形成率。

1.2.5

流式細胞術檢測細胞凋亡情況

恒溫離心機保持4 ℃，離心 5 min 收集細胞；收集細胞后加入 100 μl Binding Buffer 重懸細胞并加入5 μl Annexin V-FITC和 5 μl PI，輕輕混勻；室溫避光孵育 15 min并加入400 μl Binding Buffer 使用流式細胞儀檢測。

1.2.6

Transwell檢測細胞侵襲情況

參照Hu et al的Transwell研究方法。將細胞培養 24 h后，制成無 FBS 懸浮液恒溫培養1 d后，隨機選取視野使用顯微鏡觀察細胞形態，同時統計細胞數量。

1.2.7

Western

blot檢測蛋白表達水平

按照Western blot 檢測方法操作，使用蛋白質條帶用掃描儀進行掃描，以GAPDH為內參，應用Imagaquent 5.1軟件對Ki67、Caspase-3、VEGF、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamy-cin，mTOR) 、p-mTOR蛋白質條帶灰度進行相對定量分析。小鼠單克隆抗體Ki67、Caspase-3、VEGF、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR克隆IgG1(稀釋比例均為1 ∶1 000)，HRP羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG二抗(稀釋比例均為1 ∶5 000)以目的蛋白條帶與β-actin灰度比值表示蛋白相對表達水平。實驗重復3次，取平均值為最終結果。

1.2.8

免疫組化染色檢測相關蛋白的表達

取小鼠舌鱗癌組織切片，經過烤片、常規二甲苯脫蠟、酒精脫水、在37 ℃下孵育10 min，PBS沖洗、修復抗原、封閉、滴加一抗后在4 ℃下孵育過夜，使用蘇木精復染、透明、干燥、封片。

1.2.9

裸鼠模型試驗

將60只裸鼠皮下注射舌鱗癌細胞SCC9建立舌鱗癌模型，分別口服灌胃將低中高劑量12.5、25、50 mg/(kg·d)的TET，并設置空白對照組，注射等量的0.9%氯化鈉溶液。29 d后，檢測瘤子重量，免疫組化法檢測結腸癌組織Ki67、caspase-3和VEGF 的表達。

2 結果

2.1 舌鱗癌SCC9細胞增殖情況

由圖1可見，與空白對照組比較，低劑量TET組細胞克隆形成率和細胞增殖相關蛋白Ki67表達水平降低(

P

<0.05)；與低劑量TET組比較，中劑量TET組細胞克隆形成率和細胞增殖相關蛋白Ki67表達水平降低(

P

<0.05)；與中劑量TET組比較，高劑量TET組細胞克隆形成率和細胞增殖相關蛋白Ki67表達水平降低(

P

<0.05)。

2.2 舌鱗癌SCC9細胞凋亡情況

由圖2可見，與空白對照組比較，低劑量TET組細胞凋亡率及凋亡相關蛋白Caspase-3表達水平升高(

P

<0.05)；與低劑量TET組比較，中劑量TET組細胞凋亡率及凋亡相關蛋白Caspase-3表達水平升高(

P

<0.05)；與中劑量TET組比較，高劑量TET組細胞凋亡率及凋亡相關蛋白Caspase-3表達水平升高(

P

<0.05)。

2.3 舌鱗癌SCC9細胞侵襲情況

由圖3可見，與空白對照組比較，低劑量TET組舌鱗癌細胞SCC9侵襲數目及細胞遷移相關蛋白VEGF表達水平降低(

P

<0.05)；與低劑量TET組比較，中劑量TET組舌鱗癌細胞SCC9侵襲數目及細胞遷移相關蛋白VEGF表達水平降低(

P

<0.05)；與中劑量TET組比較，高劑量TET組舌鱗癌細胞SCC9侵襲數目及細胞遷移相關蛋白VEGF表達水平降低(

P

<0.05)。

圖1 舌鱗癌SCC9細胞克隆形成率及Ki67表達情況

圖2 舌鱗癌SCC9細胞凋亡情況

2.4 TET對舌鱗癌SCC9細胞相關信號通路影響

由圖4可見，與空白對照組比較，低劑量TET組PI3K、AKT、mTOR表達水平差異無統計學意義，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表達水平及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR降低(

P

<0.05)；與低劑量TET組比較，中劑量TET組的PI3K、AKT、mTOR表達水平差異無統計學意義，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表達水平及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR降低(

P

<0.05)；與中劑量TET組比較，高劑量TET組PI3K、AKT、mTOR表達水平無差異無統計學意義，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表達水平及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR降低(

P

<0.05)。

2.5 TET對裸鼠體內成瘤的影響

由圖5可見，與空白對照組比較，低劑量TET組裸鼠腫瘤細胞質量、Ki67陽性率、VEGF陽性率降低(

P

<0.05)，CaspasE-3陽性率升高(

P

<0.05)；與低劑量TET組比較，中劑量TET組裸鼠腫瘤細胞質量、Ki67陽性率、VEGF陽性率降低(

P

<0.05)，CaspasE-3陽性率升高(

P

<0.05)；與中劑量TET組比較，高劑量TET組裸鼠腫瘤細胞質量、Ki67陽性率、VEGF陽性率降低(

P

<0.05)，CaspasE-3陽性率升高(

P

<0.05)。

圖3 舌鱗癌SCC9細胞侵襲情況

圖4 TET對舌鱗癌SCC9細胞相關信號通路影響

3 討論

增殖細胞周期相關核抗原(Ki67)的分子量為345 ku，它所編碼的基因位于10號染色體上，是一種細胞核內與細胞分裂增殖相關的蛋白抗原，其表達水平反映細胞增殖的敏感指標同時這種基因在維持結構方面起著重要作。石小燕 等發現,Ki67的表達與細胞增殖密切相關，是調節細胞周期重要組成部分。本研究顯示，使用TET處理后細胞中Ki67水平降低，說明TET可以抑制Ki67的表達，從而抑制癌細胞的增殖，且隨著使用TET處理的濃度的升高對癌細胞抑制程度增強。鄭駿年 等研究表明，降低細胞內Ki67的表達可以有效降低癌細胞的增殖，達到抑制癌細胞的作用，與本研究得出的結論相一致。

凋亡也是調控癌細胞必不可少的重要調控因子。其中Caspase是細胞凋亡的核心，Caspase-3、Caspase-9等是Caspase家族的凋亡因子。Caspase-9基因處于Caspase 家族激活基因的頂端，是Caspase家族中最常見的凋亡啟動子，通過自身的裂解使得 proCaspase-3 產生有活性的 Caspase-3。這種有活性的 Caspase-3是執行凋亡的基因，主要作用機制是通過剪切另外的 Caspase 底物引起級聯反應，最終導致細胞凋亡。本實驗中可以看出，使用TET處理后細胞中Caspase-3水平升高，說明TET可以有效促進細胞中的Caspase-3表達，使得癌細胞凋亡，且隨著使用TET處理的濃度的升高對癌細胞促凋亡作用增強。劉安 等研究表明：升高癌細胞中Caspase-3的表達可以促進癌細胞的凋亡，與本研究得出的結論相一致。

圖5 TET對裸鼠體內成瘤的影響

PI3K受到各種生長因子等刺激后，PI3K的激活將導致 3，4-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2) 轉化為3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇 (PIP3) 再激活諸多下游蛋白。Akt是一種進化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，PI3K活化后會在細胞膜上生成PIP3，形成的PIP3再和 Akt N端的PH結構域結合，使得Akt從細胞質轉移到細胞膜上。磷酸化Akt蛋白被激活后再到胞漿中或者胞核內，將磷酸化一系列底物，進而發揮促進細胞增殖。哺乳動物mTOR是PI3K蛋白激酶類家族的一員，存在兩種不同的復合體:mTOR和raptor(regulatory-associated protein of mTOR)可以促進Akt分子中的殘基磷酸化，導致Akt的激活。PI3K/AKT/mTOR信號通路在腫瘤中有多種作用，其中包括：抑制細胞凋亡、促進腫瘤轉移、增加腫瘤的耐藥性、抑制參與細胞自噬。本研究顯示使用TET可以有效抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路，促進了癌細胞的凋亡、抑制了腫瘤轉移調控了細胞的凋亡，與秦蓉 等研究表明TET可以有效抑制腫瘤的增殖、侵襲及凋亡的結論相一致。

綜上所述，TET以通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制舌鱗癌細胞的生長、運動，促進舌鱗癌細胞的凋亡，其作用機制可能與抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路相關蛋白、促進凋亡因子Caspase-3的表達有關。但調控PI3K/AKT/mTOR信號通路的相關下游和上游位點蛋白較多，在后續的實驗中可以進一步探討TET調控PI3K/AKT/mTOR信號通路上游或下游的相關其他位點對PI3K/AKT/mTOR信號通路機制的影響。