成骨誘導劑緩釋系統對拔牙創骨改建的影響

劉旭琳，張瀟月，田 欣，陳俊良,2，何 蕓,2

牙拔除術后牙槽骨因缺乏牙齒的支持和功能性刺激會發生骨吸收，從而給后續修復治療帶來不利影響，尤其是對剩余牙槽骨骨質和骨量要求頗高的骨支持式修復方式—種植修復。研究表明70%～80%骨吸收發生在拔牙后的最初3個月，且水平向骨喪失量多于垂直向。如果能在拔牙同時采取措施，有效促進成骨，能對牙槽嵴形態的維持起到重要作用。雖然，很多學者嘗試將生物材料局部應用于拔牙窩，期望能促進成骨；但是目前尚沒有公認理想的生物材料。前期研究顯示將由地塞米松、β-甘油磷酸鈉和維生素C組成的成骨誘導劑(osteogenic inducer，OI)局部應用于兔拔牙窩，影像學和組織學分析顯示OI可促進拔牙創周圍早期骨改建，減少牙槽骨高度的吸收。但同時也發現一個問題：牙槽骨寬度(alveolar bone width, ABW)吸收與對照相比無明顯差異。由此推測，這可能與藥物不均勻釋放以及局部藥物濃度難以長期維持有關。因此，該研究以聚乳酸-羥基乙酸共聚物 (poly (lactic-co-glycolic acid)，PLGA)為緩釋載體，OI為有效藥物成分，研制出了黏度適宜，凝結良好，能夠緩慢、穩定釋放藥物的OI緩釋系統。且已通過體外實驗, 證實了其對成骨細胞增殖、分化的的促進作用。該研究在此基礎上，進行動物水平的體內研究，將OI緩釋系統局部應用于兔下前牙拔牙窩，觀察其對拔牙創骨改建的影響，為臨床上尋求一種操作方便、價格合理、釋放可控的生物材料以促進拔牙創骨改建奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

3月齡雄性新西蘭大白兔27只,體質量2.5～3.0 kg，由西南醫科大學動物實驗中心提供，所有動物均獨立籠養于西南醫科大學動物實驗中心，自由進食，觀察2周后用于實驗。動物實驗程序按照赫爾辛基倫理標準執行，并獲得本院倫理委員會批準(審批號:20160034)。

1.2 實驗材料

OI成分：β-甘油磷酸鈉(美國Sigma公司)、維生素C、地塞米松(北京索萊寶科技有限公司)；PLGA 75/25(大連美侖生物技術有限公司)，有機溶劑N-甲基-2吡咯烷酮(N-methyl-2-pyrrolidone, NMP)、反應性增溶劑三乙酸甘油酯(Glycerol triacetate , GTA)，上海麥克林生物科技有限公司。NMP與GTA體積比為5 ∶5，PLGA質量分數為40%，OI體積分數為15%。

1.3 儀器設備

正置相差顯微鏡BX50(日本Olympus公司)，旋轉式石蠟切片機RM2235(德國Leica公司),KODAK 9500錐形束CT(cone beam CT, CBCT) ( 美國Care stream Health公司)，Mimics Research軟件(比利時Materialise公司)，Image-Pro Plus圖像分析軟件(美國Media Cybernetic公司)。

1.4 實驗方法

將27只新西蘭大白兔隨機分為PLGA+OI組、PLGA組和空白組，每組各9只。用3%戊巴比妥鈉經耳緣靜脈注射對實驗兔進行全身麻醉，麻醉劑量30 mg/kg。角膜反射消失后取仰臥位固定于手術臺，手術區消毒，碘伏消毒口腔，牙周探針分離牙齦，微創拔牙挺配合牙鉗微創拔除雙側下頜前牙，搔刮沖洗牙槽窩，清除殘余骨屑等。PLGA+OI組拔牙創內注入OI緩釋系統1.0 ml，使其填塞整個拔牙窩(圖1)；PLGA組注入空載PLGA凝膠1.0 ml；空白組不作處理，用可吸收線拉攏縫合牙齦。術后連續3 d肌肉注射青霉素(每天3次，每次80萬單位)。術后1周，喂流質食物，每周調磨上頜前牙，避免其過度生長而導致咬合創傷。密切觀察傷口愈合情況及實驗兔的精神和活動情況。分別于術后2、4、8周時，每組隨機處死3只實驗動物，取下前牙區牙槽骨標本，拍攝CBCT后立即用10%多聚甲醛固定，EDTA脫鈣，制作組織切片備用。

圖1 微創拔除新西蘭大白兔雙側下前牙

1.5 影像學檢查

CBCT拍攝參數：5.0 mA ，120 kV曝光9.6秒,層厚0.2 mm。每張CBCT均選擇3個切面進行測量，每個切面隨機測3次。骨密度值(bone mineral density, BMD)用Mimics Research軟件的密度測量工具進行測量，測量位置為高于下頜骨下緣 4、6、8 mm的3 個水平切面，切面厚度1 mm，每個切面隨機選擇拔牙窩內5 mm 周徑的矩形區域進行分析(圖2)，以測量的平均CT值記錄為該樣本的密度。ABW和牙槽骨高度(alveolar bone height, ABH)變化值以8周組動物的拔牙前CBCT測量值(CBCT Ⅰ)減去處死后CBCT測量值(CBCT Ⅱ)表示。寬度的測量位置同BMD，測量各平面上的最大寬度。高度測量在3個矢狀面切面上進行，分別是：拔牙窩頰側切平面，舌側切平面，以及前2 個平面的中間平面，以下頜骨下緣到牙槽骨頂點的最大值作為高度值(圖3)。

圖2 測量BMD值 A：測量位置； B：測量區域

圖3 測量ABW和ABH A：ABW測量示意；B：ABH測量位置；C：ABH測量示意

1.6 組織學檢查

取各組實驗標本于多聚甲醛中固定48 h，EDTA脫鈣2個月，乙醇逐級脫水，石蠟包埋，做拔牙窩冠狀位切片，切片層厚2～3 μm，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，正置相差顯微鏡觀察新生骨組織情況。每張切片均在×100下進行觀察。通過Image-Pro Plus(Media Cybernetic,Silver Springs,MD,USA)圖像分析軟件對標本切片進行測量，每張切片均選取拔牙創正中位置水平方向連續3個視野，計算新生骨小梁的面積比。

2 結果

2.1 骨密度測量結果

隨著術后時間的延長，各組骨密度均不斷增加。術后2、4、8周，PLGA+OI組BMD均大于PLGA組和空白組，PLGA組大于空白組，差異有統計學意義(

P

<0.001)，見表1。

表1 各組不同時間點BMD測量值

2.2 ABW及ABH測量結果

術后8周，ABW及ABH變化值測量結果見表2，可見各組數據均為正數，說明各組的ABW和ABH均出現了不同程度的吸收。PLGA+OI組寬度與高度變化值均小于PLGA組與空白組，差異有統計學意義(

P

<0.001)。

表2 術后8周各組ABW和ABH變化值

2.3 組織學觀察結果

術后2周，PLGA+OI組(A1)可見較多新生骨島，成骨細胞規則排列在新生骨組織周圍，PLGA組(B1)和空白組(C1)新生骨較少，可見大量血細胞及纖維結締組織。術后4周，PLGA+OI組(A2)新生骨組織相互連接形成板層狀類骨質，骨小梁較粗大，排列整齊，PLGA組(B2)間質內仍可見大量血細胞，空白組(C2)纖維結締組織較多，少量骨組織散在分布。術后8周，PLGA+OI組(A3)，已形成成熟板狀骨，骨板致密，與周圍骨組織完全融合，PLGA組(B3)新生骨組織排列紊亂，可見破骨性陷窩，空白組(C3)新生骨組織未完全融合(圖4)，定量分析結果見表3。

表3 各組不同時間新生骨面積百分比

3 討論

拔牙創的骨改建是成骨細胞主導的新骨形成和破骨性吸收之間的動態平衡，其中新骨形成起著重要的作用。而拔牙創愈合過程中，上皮細胞和結締組織向拔牙創內生長速度比骨組織更快，使軟組織優先占據拔牙窩，使骨形成相對減少，從而導致牙槽嵴高度和寬度降低。因此促進牙拔除術后拔牙窩的早期骨改建對牙槽嵴形態的維持及后續修復治療具有重要作用。目前研究較多的局部應用藥物及材料有Bio-Oss骨粉、重組人形態發生蛋白-2、富血小板纖維蛋白等。但由于這些材料存在價格較貴、遠期效果尚不確定等缺陷，目前尚沒有公認一致的材料可用于拔牙后促進牙槽骨改建。理想的骨組織工程支架應具備以下特點：具有良好的生物相容性，骨傳導性和骨誘導性，其降解速率與骨生長速率相匹配，促進骨質的沉積和生長，其降解產物無毒性，經濟易得等。在前期研究表明局部應用由10mmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉和50 mg維生素C組成的OI，能促進新西蘭兔拔牙創骨愈合的基礎上，利用PLGA作為緩釋載體，構建OI緩釋系統，通過觀察研究不同溶劑配比、溶劑用量、PLGA質量分數和OI體積分數對凝膠性狀、凝結時間、凝膠黏度和藥物累積釋放率的影響，發現溶劑N-甲基-2吡咯烷酮 ∶三乙酸甘油酯體積比為5 ∶5,PLGA質量分數為40%,OI體積分數為15%的凝膠黏度適宜，凝結良好，藥物濃度維持時間達14 d以上。本實驗將以PLGA凝膠為載體的OI緩釋系統局部應用于兔下前牙拔牙窩，影像學結果提示OI緩釋系統能較快提高新骨骨密度，并減少拔牙創愈合早期ABW和ABH的吸收。組織學結果提示PLGA+OI組新生骨組織速度優于PLGA組和空白組。

OI緩釋系統促進牙拔除術后早期骨改建，降低ABW及ABH吸收的機制可能與以下幾個因素有關：PLGA凝膠一方面使OI的釋放均勻緩慢，延長了藥物作用時間；另一方面作為支架結構阻擋上皮細胞、成纖維細胞及軟組織的長入，為成骨細胞向拔牙窩內的增殖分化提供足夠空間。OI緩釋系統藥物成分能有效促進成骨細胞增殖與分化。其藥物成分的成骨誘導機制與以下幾個因素有關：① 地塞米松可以顯著增加骨髓基質干細胞的堿性磷酸酶活性，刺激細胞外膠原基質的合成、鈣的沉積和礦化結節的形成。同時，地塞米松能刺激骨改建重要核心因子的表達并增強其的活性，使成骨標志基因(骨鈣素、Ⅰ型膠原、骨橋蛋白等)的轉錄增加，從而刺激BMSCs向成骨細胞分化，并激活成骨細胞功能。② β-甘油磷酸鈉則可以為成骨細胞提供磷酸離子，促進生理性鈣鹽的沉積和鈣化，從而加速節結鈣化。③ 維生素C可以調節堿性磷酸酶的活性，啟動鈣化; 同時，能促進細胞合成膠原，形成鈣化，促進成骨。

圖4 HE染色結果 ×100 A：PLGA+OI組；B：PLGA組；C：空白組;1、2、3：隨機選取不同位置

綜上所述，以PLGA凝膠為載體的OI緩釋系統可有效延長OI作用時間，促進兔拔牙創早期骨愈合，降低ABW和ABH的吸收值。此生物材料制作簡便，臨床應用程序簡便、易于掌握，價格相對便宜，為牙拔除術后牙槽嵴形態的維持提供了新方法。