血清microRNA-337表達水平對自擬強腎健脾通絡湯方劑治療早期糖尿病腎病獲益的診斷價值研究

劉紅梅，張月，劉曉曼，安致穩，王 倩（唐山市中醫醫院，河北唐山 063000）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy,DN）可進展為終末期腎臟病，嚴重威脅著人們的生命安全[1-3]，及早治療可在一定程度上抑制其進展[4]。目前，臨床主要應用降糖、降壓、降脂等藥物延緩糖尿病腎病進展，但對于降低微量蛋白尿的效果有限[5-6]。中醫對糖尿病腎病的治療有獨到見解，可控制患者病情，并改善相關指標水平[7-9]。本研究用自擬強腎健脾通絡湯治療早期糖尿病腎病，效果顯著，但仍有部分患者對治療不敏感，因此，及早評價治療獲益尤為重要。微RNA-377（microRNA-377，miR-377）可通過調控炎癥因子水平損傷糖尿病腎病大鼠腎臟足細胞[10]，其水平與腎臟損傷有關，或可反映治療獲益情況。目前，鮮有研究分析miR-337 對糖尿病腎病治療獲益的診斷價值。本研究主要分析miR-337 評價自擬強腎健脾通絡湯方劑治療早期糖尿病腎病獲益的價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2017年4月～2018年11月在唐山市中醫醫院就診的136 例早期糖尿病腎病患者作為研究對象，年齡33～69（46.80±7.14）歲，男性75 例，女性61 例。納入標準：診斷符合《糖尿病腎病防治專家共識（2014年版）》[11]和《糖尿病腎病中醫防治指南》[12]，臨床分期為Ⅲ期，簽署知情同意書。排除標準：認知功能障礙或伴精神疾病，嚴重心、肝、肺等臟器功能異常，伴感染性疾病，妊娠期或哺乳期婦女，對本研究藥物過敏或退出研究。根據治療獲益分為預后良好組（n=84）和預后不良組（n=52）。兩組的年齡、性別、體質量指數（body mass index，BMI）、病程和吸煙史比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），見表1。本研究經唐山市中醫醫院醫學倫理委員會批準。

表1 兩組基線資料比較（±s）

表1 兩組基線資料比較（±s）

類別預后良好組（n=84）預后不良組（n=52）t/χ2P年齡（歲）47.35±6.8145.92±7.621.1310.260男性46290.0130.909 BMI（kg/m2）25.76±3.8125.74±4.450.0320.974病程（年）7.08±1.276.96±1.200.5540.581吸煙41270.1250.724

1.2 試劑與儀器 TAKARA 9108 RNAiso Plus 9108 trizol RNA，6011A PrimeScript? 1st Strand cDNA Synthesis Kit（日本TAKARA 公司）；紫外分光光度計（上海光學儀器五廠有限公司）；PCR 儀（美國Bio-Rad 公司），miR-337 及內參U6 引物（上海吉瑪制藥技術有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 治療方案：給予常規治療，包括飲食、運動干預，降糖、降壓和降脂治療等。在常規治療基礎上給予自擬強腎健脾通絡湯治療。自擬強腎健脾通絡湯組方：黃芪15 g，黨參10 g，白術10 g，益智仁15 g，芡實10 g，金櫻子10 g，菟絲子10 g，水蛭3 g，桃仁10 g，甘草6 g。上述藥物煎服，每天早、晚各服用1 次，12 周為1 療程。

1.3.2 治療獲益評價標準：隨訪2年，每3 個月隨訪1 次，末次隨訪時間為2020年11月28日，將臨床分期進展為Ⅳ期、血肌酐水平翻倍、接受腎臟替代治療或全因死亡定義為預后不良。

1.3.3 信息收集：收集年齡、性別、BMI，吸煙史、糖尿病病程、估算的腎小球濾過率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（serum creatinine，Scr）、尿酸（uric acid，UA）和尿清蛋白/肌酐比值（urine albumin/creatinine ratio，UACR）等信息。

1.3.4 miR-337 水平檢測：用實時熒光定量PCR法（RT-qPCR）[13]檢測血清miR-337 水平。抽取受試者治療前、治療后肘部靜脈血10 ml，離心后取上清，將其保存在-80℃冰箱中保存，待驗。用TRIzol 提取血清中總RNA，用逆轉錄試劑盒將RNA 反轉錄成cDNA，然后用PCR 儀擴增cDNA，擴增條件為95 ℃ 10 min，95 ℃ 60 s，40個循環，63 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s。miR-337 序列F：5’-CTCAACTGGTGTCGTCCAGTCGGCA-3’，R：5’-ATTCAGTTGAGGAAGAAAGG-3’；內參序列U6 F：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，R：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。用2-ΔΔCt計算miR -337 相對水平。

1.4 統計學分析 用SPSS 25.0軟件進行統計分析。計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較用獨立樣本t檢驗，兩組治療前、后的miR-337 水平比較用重復測量方差分析，率的比較用χ2檢驗，用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）評估miR-337 診斷治療獲益的價值，用Logistic 回歸分析治療獲益的獨立風險因素，用限制性立方樣條擬合Logistic 回歸分析miR-337 與治療獲益的劑量-效應關系。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組腎功能指標比較 見表2。兩組的UA 水平差異無統計學意義（t=1.287，P＞0.05），預后良好組的eGFR 水平高于預后不良組，BUN，Scr和UACR 水平低于預后不良組，差異均有統計學意義（t=6.119，5.798，3.704，5.506，均P＜0.05）。

表2 兩組腎功能指標比較（x±s）

2.2 兩組miR-337 水平比較 見表3。兩組的miR-337 水平差異有統計學意義（F=24.876，P=0.000），預后良好組治療后miR-337 水平低于預后不良組（P=0.000）；治療前、后的miR-337 水平差異有統計學意義（F=339.737，P=0.000），兩組治療后的miR-337 水平均降低；預后和時間之間存在交互效應（F=22.794，P=0.000），治療后，兩組的miR-337 水平降低程度不同，預后良好組的miR-337 水平降低程度高于預后不良組（P=0.000）。

表3 兩組miR-337 水平比較（x±s）

2.3 miR-337 評價早期糖尿病腎病治療獲益的效能見圖1。治療前miR-337 評價治療獲益的ROC 曲線下面積（AUC）、最佳截斷點、靈敏度和特異度分別為0.568（95% CI：0.470～0.667），1.64，86.54%和28.57%；治療后miR-337 評價治療獲益的ROC AUC，最佳截斷點、靈敏度和特異度分別為0.837（95% CI：0.764～0.910），1.57，65.38%和90.48%；差值miR-337 評價治療獲益的ROC AUC，最佳截斷點、靈敏度和特異度分別為0.722（95% CI：0.638～0.806），0.44，88.46%和46.43%。治療后miR-337 評價治療獲益的ROC AUC 高于治療前miR-337和差值miR-337，差異均有統計學意義（Z=6.039，P=0.000；Z=2.288，P=0.022）。

圖1 miR-337 評價治療獲益的ROC 曲線

2.4 早期糖尿病腎病治療獲益的Logistic 回歸分析 見表4。將治療獲益作為因變量，將eGFR，BUN，Scr，UACR 和miR-337（治療后）作為自變量，多因素Logistic 回歸分析結果顯示，高水平的eGFR是治療獲益的獨立保護因素（P=0.000），高水平的Scr，UACR 和miR-337 是治療獲益的獨立危險因素（P=0.019，0.005，0.000）。

表4 早期糖尿病腎病治療獲益的Logistic 回歸分析

2.5 miR-337 與早期糖尿病腎病治療獲益的劑量-效應關系 見圖2。用限制性立方樣條擬合Logistic 回歸分析miR-337 與治療獲益的劑量-效應關系，當節點個數為3 時，AIC 值最小（AIC=136.065），結果顯示miR-337 與治療獲益有關（χ2=32.89，P=0.000），呈線性關系（非線性檢驗χ2=0.76，P=0.382）。以miR-337 評價治療獲益的最佳截斷點作為參考點，當miR-377 ＜1.57時，治療獲益率增加；當miR-337 ＞1.57 時，治療獲益率降低。

圖2 miR-337 與治療獲益的限制性立方樣條圖

3 討論

抑制早期糖尿病腎病進展可有效改善患者預后[14-15]。中醫學認為腎是人體的先天之本，主藏精，需水谷精微補充與化生；脾是人體的后天之本，主運化，需腎中陽氣溫煦。本研究在“脾病及腎”、“脾胰同源”理論下用自擬強腎健脾通絡湯治療早期糖尿病腎病，經臨床觀察，效果明顯，但仍有部分早期糖尿病腎病患者經自擬強腎健脾通絡湯治療后遠期獲益甚微。miR-337 已被報道參與了黑色素瘤[16]和胰腺導管腺癌[17]的發病和進展過程，并可反映患者預后。本研究認為miR-337 可能是早期糖尿病腎病治療獲益的潛在生物標志物，因此，開展本研究，分析miR-337 診斷早期糖尿病腎病治療獲益的價值。

本研究結果顯示預后良好組的治療后miR-337水平低于預后不良組，且預后良好組治療后的miR-337 水平降低程度高于預后不良組，上述結果提示miR-337 與治療獲益有關，可能是評價治療獲益的潛在生物標志物。遂構建了miR-337 評價治療獲益的ROC 曲線，結果顯示治療后miR-337 對治療獲益有一定診斷價值。

進一步用Logistic 回歸分析自擬強腎健脾通絡湯治療早期糖尿病腎病獲益的風險因素，結果顯示，miR-337 是治療獲益的獨立危險因素，此外，限制性立方樣條擬合Logistic 回歸分析結果顯示miR-337 與治療獲益呈線性關系，當miR-377 ＜1.57 時，治療獲益率增加；當miR-337 ＞1.57 時，治療獲益率降低。推測其原因是自擬強腎健脾通絡湯方劑可調節miR-337，miR-337 可靶向調控白細胞介素-6 和白細胞介素-18 水平加重腎臟損傷[10]，其水平可反映治療獲益。本研究結果還顯示高水平的eGFR 是治療獲益的獨立保護因素，高水平的Scr和UACR 是治療獲益的獨立危險因素，與已報道文獻[18-20]結果一致。

綜上所述，血清miR-337表達水平對自擬強腎健脾通絡湯方劑治療早期糖尿病腎病獲益有一定診斷價值。