深圳地區類風濕關節炎患者IL-17A基因rs2275913位點多態性與血清中IL-17A，IL-38水平表達的相關性研究

雷明玲，彭常基，張肄鵬，楊海珊

（1.深圳市龍華區中心醫院檢驗科，廣東深圳 518110；2.深圳市龍崗區南灣預防保健所，廣東深圳 518114）

類風濕關節炎（rheumatic arthritis，RA）是以侵蝕性關節炎為主要病變的一種全身慢性自身免疫性疾病，主要表現為關節炎癥、滑膜T 細胞浸潤及滑膜增生，并伴有軟骨和骨的侵蝕及漸進性關節破壞，其致畸和致殘率高，嚴重影響人們健康和生活質量[1-2]。但RA 發病機制至今不明，有研究表明，RA 發病可能與炎性細胞因子產生有關，其中白介素-17（IL-17）是輔助性T 細胞17（Th17）分泌的一種主要效應因子，能誘發并促進炎癥發生，與RA 發生和發展有關[3-5]。IL-38 是最近新發現的一種抑炎因子，與IL-36 受體結合，能抑制Th17 相關細胞因子如IL-17，IL-22 等的合成，在自身免疫性關節炎中發揮抗炎作用[6-8]。同時研究表明，IL-17基因單核苷酸多態性可影響IL-17 的產生而與多種自身免疫性疾病有關，其中IL-17F 基因多態性與RA 發病相關性已見報道[9]，但IL-17A 基因多態性與RA 發病相關性未見報道，且基因多態性分布具有區域和種族性差異。為此，本研究對深圳地區103 例RA 患者和116 例非RA 健康人群IL-17A基因rs2275913位點多態性與血清中IL-17A，IL-38水平表達的相關性進行了對比分析，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2019年2月～2020年10月在深圳市龍華區中心醫院確診的RA 患者103 例，其中男性27 例，女性76 例，男∶女為1∶2.81，年齡35～72 歲，平均年齡49.63±12.75 歲。所有患者均符合RA 診斷標準，并根據RA 疾病活動度評分標準（DSA280）[10]進行分期，其中輕度活動組29 例（DSA28＜3.2），中度活動組56 例（3.2＜DSA28＜5.1），高度活動組18 例（DSA28＞5.1）。納入標準：①符合RA 診斷標準；②初確診者；③未使用抗風濕藥；④醫院倫理委員會同意批準；⑤患者及家屬知情同意。排除標準：①伴有其他自身免疫性疾病者；②病情加重者；③伴有腫瘤、糖尿病及血液等疾病者；④伴有嚴重器質性病變者；⑤需采取非常規治療者；⑥懷孕及哺乳期婦女。選擇同期非RA 疾病的健康人群116 例，其中男性31 例，女性85 例，男∶女為1∶2.74，年齡33～74 歲，平均年齡50.27±13.52 歲，均無自身免疫性疾病、骨及關節相關性疾病。確保兩組的年齡、性別及男女比例等一般性資料差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 儀器與試劑 DXI800 全自動化學發光免疫分析儀由美國Bankman 公司提供；DNA 提取試劑盒由深圳亞能生物技術有限公司提供；ABI7500 PCR基因擴增儀由美國ABI 公司提供。

1.3 方法

1.3.1 標本采集：于清晨空腹采集5 ～6ml 靜脈血，其中2～3ml 加入乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）抗凝管內上下充分顛倒混勻用于全血DNA 提取，剩余的加入無抗凝劑的一次性干燥管內，30min 后分離血清用于IL-17A，IL-38 及RF 水平檢測。

1.3.2 IL-17A，IL-38 及RF 水平測定：采用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測血清中IL-17A 和IL-38水平，RF 水平采用免疫比濁法進行檢測，所有操作均嚴格按照儀器和試劑盒說明書進行，并由專人成批次檢測，確保結果的準確性和可比性。

1.3.3 全血DNA 提取：采用DNA 提取試劑盒（深圳亞能生物技術有限公司提供）提取外周血中單個核細胞的基因組DNA，對合格的DNA 提取標本用雙蒸水稀釋至100ng/L，于-20℃冰箱內備用。

1.3.4 多態性分析：采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）法對IL-17A基因rs2275913位點多態性進行分析，具體操作參照文獻[11]。

1.4 統計學分析 采用GraphPad Prism 5 軟件，計量資料以均值±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，兩組間比較采用χ2檢驗，多組間比較采用方差檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組IL-17A，IL-38 及RF 水平比較 見表1。RA 組IL-17A 和RF 水平比對照組明顯升高，而IL-38 水平比對照組明顯降低，兩組比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

表1 兩組IL-17A，IL-38 及RF 水平比較（x±s）

2.2 RA 組不同活動度患者IL-17A，IL-38 及RF 水平比較 見表2。RA 組隨著病情活動度的加重IL-17A 和RF 水平明顯升高，而IL-38 水平明顯降低，不同活動度間差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

表2 RA 組不同活動度患者IL-17A，IL-38 及RF 水平比較（x±s）

2.3 兩組IL-17A基因rs2275913位點基因型和等位基因檢出率比較 見表3。RA 組IL-17A基因rs2275913位點AA 基因型和A 等位基因檢出率比對照組明顯升高，兩組差異有統計學意義（P＜0.05）。

表3 兩組IL-17A基因rs2275913位點基因型和等位基因檢出率比較[n(%)]

2.4 RA 組不同基因型患者IL-17A，IL-38 及RF水平比較 見表4。RA 組AA 基因型IL-17A 水平比AG 和GG 基因型明顯升高，而IL-38 水平明顯降低，不同基因型之間差異均有統計學意義（均P＜0.05），但不同基因型RF 水平差異無統計學意義（P＞0.05）。

表4 RA 組不同基因型患者IL-17A，IL-38 及RF 水平比較（x±s）

2.5 RA 組IL-17A 與IL-38，RF 水平相關性分析 RA組IL-17A 和RF 水平明顯升高，而IL-38 水平明顯降低，經Spearman 相關性分析，結果顯示RA 組血清中IL-17A 與RF 水平呈正相關（r=0.5012，P＜0.05），而與IL-38 水平呈負相關（r=-0.6924，P＜0.05）。

3 討論

IL-17 主要由活化的T 細胞產生誘導炎癥反應的一種早期啟動因子，與受體結合后，可通過絲裂原活化蛋白（MAP）激酶和核轉錄因子kB（nuclearfactor kB，NF-kB）途徑促進T 細胞激活和刺激上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞產生IL-6，IL-8，粒細胞-巨噬細胞刺激因子（GM-CSF）、化學增活素及細胞黏附分子1（cellular adhesion molecule 1，CAM-1）等多種細胞因子，從而導致炎癥產生。另外，IL-17 還可通過促進釋放前炎性細胞因子來放大炎癥反應。有研究表明，IL-17 與RA 的發生和發展有密切關系，甚至發揮了至關重要的作用[4-5,12]。RF 是一種抗人或動物IgG 分子Fc 片段抗原決定簇的自身抗體，與體內變性結合形成免疫復合物是導致自身免疫病骨關節損傷的主要病理基礎，與關節、骨侵蝕及關節外表現發病有一定關系，可作為評價RA 病情與預后的一個重要指標，是診斷RA 最早的血清學指標[13]。IL-38 是IL-1 家族成員之一，可與IL-1R1，IL-36R及類IL-1R 輔助蛋白1（IL-1RAPL1）結合，可通過抑制NF-kB，絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）及磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）等下游信號通路，抑制許多炎癥因子產生而發揮抑炎作用。同時IL-38 可調節巨噬細胞和樹突狀細胞，繼而抑制Th17 細胞反應。此外，IL-38 還可調控滑膜成纖維細胞，抑制骨質破壞與血管生成。有研究表明，IL-38 在RA 的發生和發展過程中具有重要的抑炎作用[14-15]。本研究結果顯示，RA 組IL-17A 和RF水平明顯升高，且隨著病情活動度加重而明顯上升，與有關文獻[3-4,13]報道基本一致，這表明IL-17A 在RA 的發生和發展過程中扮演著重要的促炎角色，可能是促進RA 炎癥反應的重要觸發因子，從而引起RF 水平升高。而IL-38 水平明顯降低，與張繼云等[7]報導的基本一致，而與肖盼盼等[4]報導的不同，這可能與不同機構所收集的RA 患者病情嚴重程度不同有關，但IL-38 水平隨病情活動度加重而明顯下降的結論基本一致，這表明了在RA 發生和發展過程中IL-38 水平降低會導致其對炎癥的抑制作用減弱，從而導致促炎因子大量產生，加速疾病的進程。此外，結果還顯示，RA 組IL-17A 與RF 水平呈正相關，而與IL-38 水平呈負相關，這可能與IL-17A 的促炎和IL-38 的抑炎互相作用有關。

RA 病因與發病機制目前尚不完全清楚，多數研究者認為RA 發病是遺傳與環境因素共同作用的結果。隨著分子生物學技術不斷深入研究發現，多種細胞因子基因多態性可增加RA 發病風險，與RA 的發生和發展有密切關系[16-17]。IL-17A 位于一個與RA 相關的基因組區域的染色體6p12 上，其基因多個位點存在多態性。有研究表明，IL-17A 基因位點多態性與RA 發病有關，且存在區域和種族性差異，如LEE 等[18]研究發現高加索人RA 患者與健康人群IL-17A基因rs2275913位點基因型及等位基因頻率存在明顯差異，與RA 發病有密切關系，而DHAOUADI 等[19]研究發現與突尼斯地區RA 易感性缺乏相關性。本研究結果顯示，深圳地區RA患者IL-17A基因rs2275913位點AA 基因型和A等位基因檢出率比健康人群明顯升高，這表明IL-17A基因rs2275913位點多態性與深圳地區RA 發病有一定相關性。同時AA 基因型RA 患者IL-17A水平明顯升高，而IL-38 水平明顯降低，這可能與IL-17A基因rs2275913位點多態性能提高IL-17，其他促炎細胞因子及趨化因子表達水平，進而抑制抑炎因子水平及功能等有關。

綜上所述，RA患者IL-17A和RF水平明顯升高，而IL-38 水平明顯降低，且與病情的活動度有密切關系，加強IL-17A，RF 和IL-38 水平檢測對RA 的診斷及嚴重程度的判別診斷具有重要的參考價值。同時IL-17A基因rs2275913位點多態性與深圳地區RA 發病易感性具有相關性，其中AA 基因型可能是該地區RA 發病的易感危險基因之一。