乳腺癌患者血清長鏈非編碼RNA mir4435-2HG表達水平與臨床病理特征的相關性研究

呂美玲，馬婕群，陳海艷

(1.長安大學醫院內科，西安 710064；2.陜西省腫瘤醫院腫瘤內科，西安 710061；3.西安國際醫學中心醫院腫瘤科，西安 710100）

乳腺癌(breast cancer,BC)是嚴重威脅全球女性生命健康最常見的惡性腫瘤，目前高居女性癌癥之首，平均每年以4%的速度持續上升且呈年輕化趨勢[1-3]，其發病隱匿、致死率高、診斷相對延遲仍是臨床存在的重大問題。因此，尋找一種新型且有效的腫瘤標志物為BC 的診斷提供更為準確和及時的信息尤為重要。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)可通過參與轉錄激活、基因沉默和染色體修飾等影響惡性腫瘤的生物學行為[4]，近年來研究發現lnc RNA mir4435-2HG 具有促進胃癌增殖、遷移和侵襲的作用[5]，其還可用作口腔鱗狀細胞癌的預后標志物。目前關于lnc RNA mir4435-2HG 與BC 的關聯研究尚未見，因此本研究通過比較BC 組和乳腺良性疾病組血清中lnc RNA mir4435-2HG 相對表達量的差異，分析lnc RNA mir4435-2HG 與BC 患者各臨床病理特征的關系，旨在為BC 的診斷和預后判斷提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2016年8月～2017年7月長安大學醫院收治的52 例BC 患者為BC 組，選擇同期49 例乳腺良性疾病患者為乳腺良性疾病組，其中乳腺纖維腺瘤18 例、乳腺囊性增生14 例和漿細胞性乳腺炎17 例，另隨機納入同期45 例體檢健康的志愿者為健康對照組。根據TNM 分期BC 組患者包含I 期8 例、II 期21 例、III 期18 例、IV 期5例。淋巴結轉移17 例，淋巴結未轉移35 例；孕激素受體(progesterone receptor,PR)陽性31 例，陰性21 例；雌激素受體(estrogen receptor,ER)陽性38 例，陰性14 例；人表皮生長因子受體2（Her2）陽性40 例，陰性12 例，本研究經由我院倫理委員會批準，三組的一般資料比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

納入標準：①BC 組納入患者術后均經病理學檢查確診；②臨床資料完整者；③自愿參加且均簽署知情同意書。

排除標準：①其他腫瘤史者；②伴有嚴重器質性疾病和慢性疾病者；③遠處器官轉移者。

1.2 儀器與試劑 Trizol 試劑購自Invitrogen 公司，SYBR Green Realtime PCR Master Mix 擴增試劑盒購自日本ToYoBo 公司，TakaRa Prime-Script RT reagent kit 購自大連寶生物工程有限公司，血清RNA 提取試劑盒購自北京天根公司，ABI 7500 Fast 熒光定量PCR 儀(美國ABI 公司)，lnc RNA mir4435-2HG 及內參引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 方法 術前空腹抽取受試者靜脈血2 ml，于4℃條件下12 000 r/min 離心10 min 分離血清，采用血清RNA 提取試劑盒提取血清總RNA，采用TakaRa Prime-Script RT reagent kit 將血清總RNA 逆轉錄為cDNA，采用實時熒光定量PCR(quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)檢測血清lnc RNA mir4435-2HG 和內參基因GAPDH 的水平，lnc RNA mir4435-2HG 引物序列為：F:5’-AGACAAGCCGT GCCTGAG-3’，R:5’-ATCTTTCAGCTGCATTCC GG-3’；GAPDH 引物序列為：F:5’-CGGAGTCAAC GGATTTGGTCGTAT-3’，R:5’-AGCCTTCTCCATG GTGGTGAAGAC-3’。反應條件依次為：95℃預變性2 min，95℃ 5s，60℃25s 共40 個循環，用2－ΔΔCt表示lnc RNA mir4435-2HG 的相對表達量。

1.4 統計學分析 采用SPSS 19.0 統計學軟件處理數據，滿足正態性分布及方差齊性的計量資料以(x±s)表示，采用t檢驗，呈非正態分布，用M(P25，P75)表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis H 檢驗，兩組間比較采用非參Mann-WhineyU檢驗，lnc RNA mir4435-2HG 的診斷價值分析采用ROC 曲線。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 三組lnc RNA mir4435-2HG 相對表達量的比較 血清lnc RNA mir4435-2HG 在BC 組[2.04(1.41，3.96)]，乳腺良性疾病組[1.21(1.00，1.39)]和健康對照組[0.99(0.84，1.15)]的相對表達量比較，差異具有統計學意義(H=28.73，P=0.00)，BC 組血清lnc RNA mir4435-2HG 的相對表達量高于乳腺良性疾病組(U=89.23，P=0.01)和健康對照組(U=91.46，P=0.02)。

2.2 血清lnc RNA mir4435-2HG 與患者臨床病理特征的關系 見表1。BC 患者血清lnc RNA mir4435-2HG 與年齡和腫瘤大小無顯著的相關性(P＞0.05)，而與淋巴結轉移、TNM 分期、ER，PR 和Her2 有顯著的相關性(P＜0.05)，差異均有統計學意義。

表1 血清lnc RNA mir4435-2HG 與患者臨床病理特征的關系[M(P25,P75)]

2.3 lnc RNA mir4435-2HG 診斷BC 的ROC 曲線 見圖1。繪制lnc RNA mir4435-2HG 診斷BC 的ROC曲線，曲線下面積(area under the curve,AUC)為0.84(95%CI:0.72～0.91，P＜0.01)，參考約登指數的最大值確定lnc RNA mir4435-2HG 診斷BC 的最佳截斷值為0.69，該截斷值對應的靈敏度和特異度分別為80.25%和70.91%。

圖1 lnc RNA mir4435-2HG 診斷BC 的ROC 曲線

3 討論

BC 位居女性惡性腫瘤的首位，約占全身惡性腫瘤的10%，每年約以4%的速度持續上升[6-7]。其致死率高且起病較隱匿，嚴重危害女性的身體健康。目前，臨床上使用的CA153 被指靈敏度和特異度均不高[8-10]。基于此，尋找一種新型且有效的腫瘤標志物為BC 的診斷提供更為準確、及時的信息意義重大。Lnc RNA 可通過表觀遺傳和轉錄及轉錄后的調控等在腫瘤中發揮多種生物學功能。早期lnc RNA mir4435-2HG 研究主要是在色素性視網膜炎作用方面，MIAO 等[11]近期指出lnc RNA mir4435-2HG 促進胃癌的增殖、轉移和遷移，早期有文獻報道指出血清lnc RNA mir4435-2HG 在口腔鱗狀細胞癌中呈異常低表達且其具有較好的預測預后的價值。倪文昌等[12]指出lnc RNA mir4435-2HG 可通過靶向miR-873-5p 調控神經母細胞瘤細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲。QIAN 等[13]指出lnc RNA mir4435-2HG 在肺癌組織中呈高表達，高表達的mir4435-2HG 可促進肺癌細胞的增殖與侵襲作用。

目前在臨床診療中BC 通用的腫瘤標志物為ER，PR 和Her2。ER 和PR 是女性重要的激素受體，同時也是激素依賴性BC 患者較直觀的腫瘤標記物。ER 和PR 與激素反應生成的復合物對癌組織分化、增殖發揮重要作用。Her2 是內源性的跨膜受體糖蛋白，其具有較強的酪氨酸激酶(tyrosine kinase,TK)活性，可顯著提升癌組織的增殖活性，因此Her2常與癌組織分化程度相關聯。本研究結果提示lnc RNA mir4435-2HG 與ER，PR 和Her2 呈顯著相關關系，提示高表達的lnc RNA mir4435-2HG 可能成為ER，PR 和Her2 BC 的靶點。

本研究結果顯示，血清lnc RNA mir4435-2HG在BC 中呈高表達，這可能是由于lnc RNA mir4435-2HG 扮演癌基因的角色，表達于BC 患者循環外周血液中，其可為BC 的診斷提供參考和依據。血清lnc RNA mir4435-2HG 與BC 患者的某些病理特征有關，比如淋巴結轉移，提示lnc RNA mir4435-2HG 可能參與了BC 的侵襲遷移過程；TNM 分期，提示lnc RNA mir4435-2HG 可能參與了BC 的惡性轉化。ROC 曲線結果顯示，lnc RNA mir4435-2HG診斷BC 的最佳截斷值為0.69，靈敏度和特異度分別為80.25%和70.91%。

綜上所述，lnc RNA mir4435-2HG 在BC 血清中高表達，可作為BC 的潛在生物學標志物。但由于本研究選取的樣本數量有限，且缺少預后和療效觀察的相關研究。在后續工作中，將加大樣本研究數量、進行隨訪和功能研究，以進一步驗證lnc RNA mir4435-2HG 在BC 中的診斷和應用價值。