慢性阻塞性肺疾病患者Nrf2基因多態性與肺功能及臨床病情判斷的相關性研究

閆海燕，楊云秀，楊云華，宋曉偉，緱 劍

(1.咸陽市第一人民醫院呼吸與危重癥醫學科,陜西咸陽 712000；2.陜西唐華四棉醫院呼吸科，西安 710038；3.西安北車醫院內科，西安 710085)

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是以持續氣流受限為特征的呼吸道疾病，呈進行性發展，嚴重影響患者生活質量，最終導致右心衰竭等嚴重后果[1-2]。報道發現COPD 已成為國內第四大死因[3]。目前，肺功能檢查作為診斷COPD 的金標準已廣泛用于臨床，但研究顯示COPD 臨床病情還與全身效應有關[4-6]。核因子相關因子2（Nuclear factor erythroid-2-related factor2，Nrf2）為轉錄因子家族成員，參與氧化應激過程[7]。有動物實驗顯示Nrf2介導的抗氧化作用可影響哮喘易感性[8]。但目前有關Nrf2 與COPD 的關系，臨床研究尚屬少見。本研究納入78 例COPD 患者作為研究對象，探討Nrf2 基因多態性在COPD 診療中的作用。報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 納入2018年6月～2020年6月78例COPD 患者作為研究對象，其中男性48 例，女性30 例；年齡59.21±13.74 歲；體重指數20.18±2.32 kg/m2。納入標準：①COPD 診斷符合中華醫學會推薦指南標準[9]；②均在本院接受規范住院治療；③患者均對研究內容知情同意，并簽署知情同意書。

排除標準：①并發有肺結核、支氣管擴張及肺源性心臟病者；②肝腎功能嚴重不全者；③并發有惡性腫瘤者；④對治療藥物過敏或未能順利完成治療者。

1.2 儀器和試劑 引物由美國Invitrogen 公司設計，PCR 酶由上海圣爾生物科技有限公司提供，illumina NovaSeq6000DNA 測序儀（上海士森視覺科技有限公司）。肺功能儀為Geratherm Spirostik Complete 型肺功能儀。

1.3 方法 采集清晨肘靜脈血5ml，以酚-氯仿法提取基因組DNA，冷凍保存備用。參照文獻設計引物：上游：5’-CCTAAAGGGGCTTCTCGG-3’，下游：5’-CGTTGCAATATCA-3’，PCR 片段長度262bp。擴增體系20μl，包括PCR Max 5.0μl，上下游引物各1.0μl，DNA 模板1.0μl，雙蒸水12μl。反應條件：95 ℃預變性120s，90 ℃變性30s，50 ℃退火30s，72 ℃延伸45s，90 ℃變性45s，45℃退火30s，45 個循環。72℃延伸10min。PCR 擴增后，以1.5g/dl 瓊脂糖凝膠確定是否擴張成功。用測序儀進行測序，并以直接測序法驗證結果。

分別在治療前和治療后采用肺功能儀檢測用力肺活量（forced vital capacity，FVC），一秒鐘用力呼氣量（forced expiratory volume in one second，FEV1%）及最大通氣量（maximal ventilation volume，MVV）水平，計算FEV1/FVC。在治療1 個療程后評估療效[10]。顯效：臨床癥狀明顯好轉，意識清晰，肺功能分級降低2 級及以上，無低氧血癥；有效：臨床癥狀緩解，意識清楚，肺功能分級降低1 級；無效：臨床癥狀無明顯改善。以（顯效+有效）/總例數×100%計算總有效率。

1.4 統計學分析 選用SPSS24.0 軟件對數據進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較行重復測量方差分析，兩兩比較行LSD-t檢驗，計數資料以（%）表示，組間行χ2檢驗，預測價值采用受試者工作曲線（receiver operator characteristic，ROC）分析，結果以曲線下面積（area under curve，AUC）表示，以AUC＞0.75 為判斷價值高，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同Nrf2 基因型COPD 患者肺功能分級見表1。Nrf2 基因多態性檢測結果顯示CC 型20例，CA 型30 例，AA 型28 例。不同Nrf2 基因型COPD 患者肺功能分級比較，差異有統計學意義（χ2=15.452，P＜0.001）。

表1 不同Nrf2 基因型COPD 患者肺功能分級[n（%）]

2.2 Nrf2 基因型與肺功能指標關系 見表2。治療前和治療后不同Nrf2 基因型COPD 患者FVC，FEV1%，FEV1/FVC 及MVV 水平比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

表2 Nrf2 基因型與肺功能指標關系（x±s）

2.3 Nrf2 基因型判斷COPD 療效的ROC 分析 見圖1。ROC 分析顯示，Nrf2 基因多態性對判斷COPD 治療效果的AUC 為0.796（SE=0.056，95%CI=0.687～0.905，P=0.001），敏感度0.767，特異度為0.729。

圖1 Nrf2 基因型判斷COPD 療效的ROC 分析

2.4 不同療效患者Nrf2 基因型分布 見表3。78 例患者顯效48 例，有效17 例，無效13 例。有效率83.33%。不同療效COPD 患者Nrf2 基因型分布比較，差異有統計學意義（χ2=10.959，P＜0.001，）。

表3 不同療效患者Nrf2 基因型分布[n(%)]

3 討論

隨著分子生物學研究深入，有關COPD 基因易感性問題逐漸引起臨床重視[11]。對COPD 基因易感性的研究可對高風險人群進行早期防治，降低COPD 發生率，并為COPD 臨床個體化治療提供依據，部分患者病情可在早期得到逆轉[12]。Nrf2 編碼基因位于2q31，通過與抗氧化反應元件（antioxidant response elements，ARE）位點結合從而達到調節靶基因表達作用。葉繁等[13]報道顯示Nrf2 可調節γ-谷氨酰半胱氨酸合酶水平，影響肺氧化劑谷胱甘肽表達，而ANO 等[14]的研究則說明Nrf2 對變態反應和氣道高反應性具有抑制作用，防止黏液細胞和嗜酸性粒細胞增生浸潤。上述機制提示Nrf2 在COPD 中可能起到保護防御作用。

Nrf2 與機體抗氧化應激關系密切。當機體受到吸煙、氣候變化等因素刺激時，Nrf2 便從Keap1-Nrf2 復合物中解離，通過穿梭運動進入細胞核內，再與ARE 啟動子區結合，發揮抑制氧化應激損傷作用[15]。另外，有研究顯示Nrf2 可通過調控苯醌還原酶、磷酸肌醇-3-激酶等[16-17]，進一步發揮保護肺功能作用。楊曼等[18]敲除COPD 小鼠模型Nrf2基因，結果顯示肺組織損傷加重，肺氣腫發生率明顯升高，這也說明Nrf2 參與COPD 病理進程。本研究對比不同基因型患者肺功能，結果顯示不同基因型患者肺功能分級差異顯著，提示Nrf2 單核苷酸多態性可能與COPD 肺功能水平相關，而rs6721961位點基因突變則可能顯著增加COPD 風險。

另外，本研究對比了不同療效患者Nrf2 基因型分布，結果顯示AA 型患者總有效率顯著低于其他兩種分型，提示Nrf2 基因多態性可能影響COPD治療效果，這也進一步說明Nrf2 基因型與COPD相關。而這對指導臨床進行個體化治療具有重要意義。本研究采用ROC 分析，結果也發現Nrf2 基因型對預測療效具有較高準確性。因而，對于AA 基因型患者，臨床應采取聯合治療，以保證療效。

綜上，Nrf2 基因多態性與COPD 病情相關，檢測Nrf2 基因多態性有助于預測療效，為臨床干預提供依據。