兒童哮喘患者外周血Th17，Th2細胞及不同來源樣本相關細胞因子表達與氣道炎癥誘導痰細胞學分類的相關性研究

陳 芬，許春華，姚 彤，安美玉，羅新輝

（新疆維吾爾自治區兒童醫院兒內科，烏魯木齊 830001）

哮喘是一種以慢性氣道炎癥和氣道高反應性為特征的異質性疾病，由多種細胞因子共同參與引起，是兒童最常見的慢性呼吸道疾病[1]。目前，根據哮喘氣道炎癥不同亞型將哮喘主要分為嗜酸性粒細胞哮喘（eosinophilic asthma，EA）和非嗜酸性粒細胞哮喘（non-eosinophilic asthma，NEA），其中NEA 半數以上為中性粒細胞性哮喘（neutrophilic asthma，NA）[2]。迄今，NA 患者氣道中性粒細胞（neutrophils，NEU）增多機制尚未明確，但研究發現其存在不依賴于Th1/Th2 免疫介導的氣道中性粒細胞性炎癥[3]。并發現，Th17 細胞及其效應因子IL-17 在哮喘發病的免疫機制中具有重要作用，Th17/IL-17 可介導NEU 的募集、活化及氣道重塑，可能是氣道NEU 增多的機制之一[4-5]。亦證實，哮喘患者血清IL-17 表達升高與哮喘嚴重程度緊密相關[6]。因此，本研究擬通過初步探究不同類型哮喘兒童外周血Th2，Th17 細胞及不同樣本來源相關細胞因子與氣道炎癥誘導痰細胞學分類的相關性，以期為臨床提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2018年4月至2020年8月我院兒童呼吸科接診的急性發作期哮喘患兒55 例作為研究對象，男性30 例，女性25 例，年齡2～14歲，哮喘診斷及嚴重程度分級符合兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016 版）[7]，經支氣管鏡檢查排除氣管支氣管狹窄、支氣管異物等氣道異常引起的喘息；均未接受糖皮質激素治療，近1月內無呼吸道感染，排除支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）病原學檢查陽性。入院后均行體格檢查、病史詢問、肺功能、胸X 線片檢查，外周白細胞計數分類及痰液培養等。根據誘導痰細胞學分類將入組哮喘患兒分為NA組24例，男性13例，女性11 例，平均年齡5.1±1.6 歲，輕-中度哮喘16 例、重度哮喘8 例；EA 組31 例，男性17 例，女性14 例，平均年齡4.8±1.9 歲，輕-中度哮喘22 例、重度哮喘9 例，兩組患兒年齡、性別、病情程度差異均無統計學意義（P＞0.05）。另選取同期50 例健康體檢兒童作為健康對照組（HC 組），男性27例，女性23例，年齡3～14歲，平均年齡5.2±1.4歲，無變態反應性疾病，無過敏性鼻炎及哮喘病史，無激素類藥物使用史，肺功能正常，近1月內無呼吸道感染。本研究獲得我院醫學倫理委員會通過，患兒家屬均知情并簽署同意書。

1.2 儀器與試劑 二硫蘇糖醇（DTT）購自美國Sigma 公司。Diff-Quick 染色購自英國Baxter Healthcare 公司。APC 標記抗人CD4 抗體；Per CPCy? 5.5 標記抗人CD8 抗體；PE 標記的抗人IL-17，IL-10 抗體及Mouse Ig G1 κ 同型對照；Alexa Fluor 488 標記的抗人BCL-2,STAT5 及Mouse Ig G1 κ 同型對照均購自美國BD 公司。qRT-PCR 檢測試劑盒購自上海吉瑪制藥技術有限公司。流式細胞儀購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；ELISA 試劑盒（型號MEXN-H3052）購自上海美軒生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 誘導痰細胞分類及計數：參照2016 版兒童支氣管哮喘診斷與防治指南[7]進行哮喘嚴重程度分級，并參照誘導痰液指導指南[8]對不同程度哮喘患兒及對照組兒童分別進行痰液誘導，咳出痰液處理備用。取處理后痰液標本500 mg，1 500 r/min，4 ℃離心，取上清低溫保存用于待測細胞因子。細胞沉淀加入DTT 處理，離心棄上清，重懸加入0.1g/dl臺盼藍，調整細胞濃度為0.3×106/ml，加120 μl痰細胞懸液甩片5 min，固定，Diff-Quick 染色，光學顯微鏡下行痰液細胞計數，分類計算NEU 和嗜酸性粒細胞（eosinophil，EOS）百分比。分組根據誘導痰細胞學分類：NA 組：NEU ≥61%且EOS＜2%；EA 組：NEU ＜61%且EOS ≥2%。

1.3.2 流式細胞儀檢測外周血Th17，Th2 細胞：采集各組兒童外周靜脈血肝素抗凝，收集培養細胞加入紅細胞裂解液，離心、棄上清、重懸，分別加入APC 標記抗人CD4 抗體和Per CP-Cy? 5.5 標記抗人CD8 抗體，孵育、洗滌、棄上清；取胞外染色細胞，加入固定破膜液，離心、重懸，于Th17，Th2 細胞檢測管分別加入PE 標記的抗人IL-17 抗體和抗人IL-10 抗體20 μl，同型對照管加入PE 標記Mouse Ig G1 κ 同型對照，孵育、洗滌、棄上清，多聚甲醛重懸，24 h 內上機檢測Th17，Th2 細胞占Th 細胞的百分比。

1.3.3 流式細胞儀檢測Th17 細胞STAT5，BCL-2 表達：操作步驟同Th17，Th2 細胞檢測，BCL-2 檢測管加入Alexa Fluor 488 標記的抗人BCL-2 和PE 標記的抗人IL-17 抗體，同型對照管加入Alexa Fluor 488 標記的Mouse Ig G1 κ 同型對照和PE 標記的Mouse Ig G1 κ同型對照20 μl，其余操作步驟同2.2。STAT5 檢測取胞外染色細胞，加入37 ℃的固定液，孵育、洗滌，加入-20 ℃破膜試劑，孵育、棄上清、重懸，檢測管加入Alexa Fluor 488 標記抗人STAT5和PE 標記抗人IL-17 抗體20 μl，同型對照管加入同BCL-2 檢測，其余步驟操作同前；24 h 內上機檢測Th17 細胞STAT5，BCL-2 表達陽性率。

1.3.4 qRT-PCR 檢測外周血單核細胞RORγt 表達：采集各組兒童外周靜脈血，利用梯度離心法分離單核細胞PBMC，取分離培養PBMC 懸液提取RNA，測定其純度，逆轉錄合成cDNA 并以此為模板行RT-PCR 反應，以β-actin 為內參。RORγt引物序列，上游5’-CGTGCGCTGCTGGCGTGACG-3’，下游5’-TGTCTCTCGCGTCACCGTTGCG-3’；β-actin 引物序列，上游5’-CAGCATACTAGCTTCA GATGC-3’，下游5’-CAATGTCGTCGTTCGTCA TG-3’；反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個循環。采用 2-△△Ct法分析RORγt 相對表達量。

1.3.5 PBMC 培養液及BALF 中IL-17，IL-10 水平檢測：使用37 ℃，100 ml 生理鹽水于病變部位行纖維鏡下支氣管肺泡灌洗，抽取各組兒童BALF。取PBMC 培養液及BALF 根據ELISA 試劑盒說明書分別檢測IL-17 和IL-10 濃度，并設置空白對照組、標準孔、待測樣品孔，每孔加入親和素標記的HRP，孵育1 h，洗滌、顯色，終止反應，測定每孔450 nm 波長處的吸光度值，繪制標準曲線回歸方程，計算相應樣品中IL-17 和IL-10 濃度。

1.4 統計學分析 采用統計軟件SPSS 19.0 進行數據分析，計量數據采用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 檢驗；計數資料采用n表示，組間比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Pearson 分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 誘導痰細胞分類計數比較 見表1。NA 組NEU%高于EA 組和HC 組，EA 組高于HC 組，差異有統計學意義（P＜0.05）；EA 組EOS%高于NA 組和HC 組，NA 組高于HC 組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 流式細胞儀檢測各組外周血Th17，Th2 細胞表達

表1 各組誘導痰細胞分類計數比較（x±s,%）

2.2 外周血Th17%，Th2%比較：見圖1，表2。NA組Th17%高于EA組和HC組，EA組高于HC組，差異有統計學意義（均P＜0.05）；EA 組Th2%高于NA 組和HC 組，NA 組高于HC 組，差異有統計學意義（均P＜0.05）。

表2 各組外周血Th17%，Th2%比較（x±s）

根據前向角、側向角圈出淋巴細胞后以CD4，CD8 設門，CD4+CD8-IL-17+細胞群為Th17 細胞亞群，CD4+CD8-IL-4+細胞群為Th2 細胞亞群。

2.3 PBMC 培養液及BALF 中IL-17，IL-10 水平比較 見表3。NA 組PBMC 培養液及BALF 中IL-17 水平高于EA 組和HC 組，EA 組高于HC 組，差異有統計學意義（P＜0.05）；EA 組PBMC 培養液及BALF 中IL-10 水平高于NA 組和HC 組，NA 組高于HC 組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表3 PBMC 培養液和BALF 中IL-17，IL-10 水平比較（x±s,pg/ml）

2.4 相關性分析 NA 組患兒誘導痰NEU%與外周血Th17%（r=0.803，P＜0.05），PBMC 培養液IL-17 水平（r=0.736，P＜0.05）及BALF 中IL-17水平（r=0.695，P＜0.05）均呈明顯正相關。EA組患兒誘導痰EOS%與外周血Th2%（r=0.759，P＜0.05），PBMC 培養液IL-10 水平（r=0.701，P＜0.05） 及BALF 中IL-10 水 平（r=0.684，P＜0.05）均呈明顯正相關。

2.5 外周血單核細胞RORγt 表達及外周血Th17細胞中BCL-2，STAT5 陽性率比較 見表4。NA組RORγt-mRNA 表達及BCL-2，STAT5 陽性率高于EA 組和HC 組，EA 組高于HC 組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表4 各組RORγt-mRNA 及Th17 細胞中BCL-2，STAT5 陽性率比較（x±s）

3 討論

氣道慢性炎癥是哮喘氣道高反應性的主要機制。既往認為，Th1/Th2 細胞免疫失衡是哮喘發病的經典免疫學機制，EOS 浸潤是哮喘典型的氣道炎癥改變，Th2 主導的免疫應答及激素治療敏感的哮喘氣道炎癥中EOS 浸潤扮演重要角色[9-10]。但近年隨著對哮喘發病機制及氣道炎癥的深入研究，發現除EOS 性炎癥外，部分重癥難治性及激素治療反應差哮喘患者氣道炎癥EOS 浸潤減少，對糖皮質激素治療不敏感，氣道組織活檢、痰液及BALF中NEU 數量明顯增多，提示哮喘氣道炎癥存在不同亞型，NEU 在哮喘氣道炎癥及氣道重塑中具有重要作用[11,4]。并發現非應變性哮喘患者存在不依賴于Th2 細胞免疫機制介導的氣道中性粒細胞炎癥[3]。本研究根據SIMPSON 等[12]研究結果以痰液NEU ≥61% 界定NA，以痰液EOS ≥2% 界定EA，經行誘導痰細胞分類及計數發現，NA 組NEU%明顯高于EA 組和HC 組，EA 組EOS%則明顯高于NA 組和HC 組，提示不同類型哮喘患兒氣道炎癥表現差異顯著。

目前，NA 患者氣道中NEU 浸潤增多的機制尚未明確，但研究發現NA 病理生理學改變，經典的Th1/Th2 失衡學說并不能完全解釋[13]。Th17 能介導炎癥反應，其效應因子IL-17 可以趨化、激活NEU 在氣道浸潤，通過與IL-17 受體結合可誘導IL-6，IL-8，TNF-α 及粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating Factor，GM-CSF）等炎癥細胞因子釋放，發揮募集、活化NEU 的功能，參與哮喘等變態反應性疾病[14-16]。既往多項實驗證實，NA 哮喘小鼠存在明顯的Th17 細胞免疫，Th17 細胞通過IL-17 介導小鼠的氣道炎癥[15]。同時臨床研究也發現，哮喘患者外周血Th17 細胞及血漿IL-17 水平明顯升高，與氣道損傷程度呈正相關[17]。提示IL-17 對NEU 的募集、活化是導致NEU 氣道炎癥的機制之一。而本研究中NA 組和EA 組患兒外周血Th17，Th2 細胞表達均較HC 組明顯增高，其中NA 組Th17 細胞升高最明顯，EA 組Th2 細胞升高最明顯，說明Th17，Th2 細胞均不同程度參與不同類型兒童哮喘的發病。與此相對應的與HC 組相比，NA 組和EA組PBMC 培養液及BALF 中IL-17，IL-10 水平也明顯升高，NA 組IL-17 水平高于EA 組，而EA 組IL-10 水平高于NA 組。相關性分析發現，哮喘患兒誘導痰NEU%與Th17%和IL-17 水平呈明顯正相關；EOS%與Th2%和 IL-10 水平呈明顯正相關。結果表明Th2，Th17 細胞及相關不同來源樣本IL-17，IL-10 細胞因子分別在EA，NA 患兒中的表達差異顯著，介導不同類型哮喘氣道炎癥，可將其作為不同類型哮喘患兒診斷、治療及預后的標志物。

Th0 細胞可分化Th17 細胞，初始Th0 向Th17 分化增強及體內已分化的Th17 細胞存活延長被認為可能是導致Th17 細胞優勢的機制之一。LIN 等[18-19]發現，Th17 細胞分化受維甲酸相關孤兒受體γt（retinoid-related orphan nuclear receptor γt，RORγt）調控，IL-6 和TGF-β 通過JAK/STAT3 途徑共同上調RORγt 表達，促進Th0向Th17 分化，使Th17 細胞數量及IL-17 分泌增多。IL-17 通過介導JAK/STAT5 途徑，可上調B 細胞淋巴瘤因子2 生存蛋白，促進T 細胞存活、增殖[20]。既往動物實驗通過NA 小鼠模型研究證實，小鼠肺組織中RORγt-mRNA 表達升高，體內已分化Th17細胞通過JAK/STAT5 途徑激活維持其存活狀態[21]。且臨床發現，哮喘患者肺組織及外周血中RORγtmRNA 高表達，IL-17 廣泛浸潤于肺組織中[22]。基于此，本研究初步分析了Th17 細胞在兒童NA 中的機制，經檢測發現NA 組和EA 組外周血單核細胞RORγt-mRNA 表達及外周血Th17 細胞BCL-2，STAT5 陽性表達較HC 組明顯升高，NA 組高于EA 組，提示RORγt 表達增強促進Th17 細胞分化和已分化的Th17 細胞存活延長應是Th17 細胞在兒童NA 中發揮優勢的機制之一，可能因JAK/STAT5信號途徑被激活引起。本研究在探究不同類型哮喘患兒外周血Th17，Th2 及相關炎性因子與氣道炎癥的相關性的同時初步分析了Th17 參與NA 的相關機制，具有一定臨床意義及可推廣性。然而本研究病例數較少，Th17 介導NA 中的作用機制還有待于擴大樣本量繼續深入探究闡明；其次本研究對于Th2 介導EA 的機制未進行初步探究分析，故可將Th17，Th2 參與不同類型哮喘的作用機制作為后期研究的新方向。

綜上，NA 與EA 患兒氣道炎癥分別表現為誘導痰NEU%，EOS%明顯增高，并分別與不同來源樣本的Th17%，IL-17 水平及Th2%，IL-10 水平呈正相關，提示可將Th2/Th17 作為不同類型哮喘患兒診斷、治療及預后的標志物。Th17 細胞可能通過IL-17 介導中性粒細胞性炎癥的發生，Th17 細胞分化增強及已分化的Th17 細胞存活延長可能是引起中性粒細胞性炎癥的機制之一。