液體活檢技術在腫瘤診斷中的最新研究進展

夏艷艷，沈 瀚，許紅攀，李智洋（南京大學醫學院附屬鼓樓醫院，南京 210008）

惡性腫瘤是嚴重危害人類健康的重大疾病，其發病率和死亡率居高不下[1]。由于腫瘤早期癥狀隱匿且多樣化，很多患者在首次診斷時已屬腫瘤晚期[2]。癌癥的預后與病程有著密切關聯，臨床研究表明，原位癌治愈率達90%以上，I 期癌癥患者的5年生存率達60%～90%，II 期患者的5年生存率約50%，而III b 和IV 期患者的5年生存率僅5%～20%，提示早期發現、診斷是改善腫瘤預后的關鍵[3]。因此，如何提高腫瘤早期診斷水平已成為腫瘤防治工作中面臨的緊迫任務。

目前腫瘤的診斷技術主要包括腫瘤標志物、計算機斷層攝影（computed tomography,CT）、組織活檢。腫瘤標志物檢測雖然操作簡單，但是其診斷的特異度和敏感度很低，只有30%和18%～70%[4]。雖然CT 針對早期腫瘤檢出率能達到40%～60%，但其假陽性率較高（達到50%以上），常導致患者過多的輻射暴露和沉重的心理負擔，甚至不必要的手術帶來的身體及經濟負擔[5]。組織活檢是確認的金標準，但是有創的侵入性操作會對患者造成生理負擔和心理影響，同時由于其只能針對少數部分進行取材，穿刺活檢也未必能獲得準確性信息[6]。因此發展敏感度及特異度更高，更加精準、無創、簡便地腫瘤早期篩查技術是臨床亟待解決的重大科學問題。

液體活檢是對患者外周血液進行檢測分析，獲得患者腫瘤相關信息的一項新興技術，主要包括循環腫瘤細胞（circulating tumor cell,CTC）、循環腫瘤DNA（circulating tumour DNA,ctDNA）和外泌體。液體活檢具有操作方便快捷、能反復獲取、易于實時監控等優點，為腫瘤的早期診斷提供了新方法。以下就液體活檢技術在腫瘤早期診斷中的應用價值以及存在的優勢和局限性進行綜述，以期為腫瘤患者早期診斷提供新方法。

1 液體活檢中CTC 在腫瘤診斷中的應用

CTC 是腫瘤細胞從原發部位分離，進入血液循環，并可以通過血液循環播散并進行遠處轉移。研究表明，CTC 在腫瘤直徑＜ 0.1 cm 時就已表現出異常，在時間上比傳統影像學早6～9 周[7]。YU 等[8]通過磁珠富集CTC，再標記腫瘤特異度配體葉酸進行PCR 檢測，結果顯示該方法診斷非小細胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）的敏感度為73.2%，特異度為84.1%，但是對I 期NSCLC 患者的診斷敏感度只有67.2%，仍舊有1/3 的漏診率。這主要是由于CTC 在血液中的含量極低（一般患者10 ml 血液中只有1～10 個CTC）、半衰期短所致，此外目前缺乏可用的特異度標志物來識別CTC，容易出現假陽性和假陰性的情況[9]。

2 液體活檢中ctDNA 在腫瘤診斷中的應用

ctDNA 也是腫瘤診斷中研究的熱點。深度測序檢測ctDNA 顯示[10]，在72%的患者中，ctDNA 可早于影像學5.2 個月檢測到腫瘤，并且在首次治療后檢測復發率的準確度達到94%。早期腫瘤患者ctDNA 等位基因移位和雜合性丟失頻繁發生，因此檢測ctDNA 能夠發現腫瘤早期基因的改變[11]。但是ctDNA 代表的是死細胞的信息[12]，半衰期僅有2 h[13]；而且含量低，約占整個循環DNA 的1%，甚至只有0.01%[14]，分離不當還會造成背景值過高，而影響檢測的靈敏度。

3 液體活檢中外泌體在腫瘤診斷中的應用

3.1 外泌體作為腫瘤標志物的優勢 外泌體可以在細胞間轉運癌基因和蛋白質，在腫瘤形成、生長、轉移和耐藥中起到關鍵作用[15]。作為腫瘤標志物的優勢體現在：①數量多，在血清中外泌體濃度可達到3×106個/μl[16]，平均每個腫瘤細胞可釋放530個外泌體/24 h[17]；②信息豐富，非常類似于腫瘤細胞。外泌體膜表面也有著和細胞膜同樣的蛋白，可以代表其親本細胞的特征和狀態[18]；③易于長期保存和去除干擾。半衰期長，有磷脂雙分子層的保護而不被蛋白酶和核酸酶降解，并且只要分離外泌體就可以去除干擾[19]；④無創檢測。外泌體可以穿過內皮進入循環系統，因此在幾乎所有的體液中可以檢測到[20]，與組織活檢相比，外泌體是個性化醫療的有效生物標志物。

外泌體相關蛋白、miRNA 等都可以作為腫瘤檢測的標志物。采用表面增強拉曼光譜對肺癌患者外泌體進行分析，結果顯示該方法區分肺癌和正常人外泌體的敏感度為95.3%，特異度為97.3%[21]，但表面增強拉曼光譜需要特定的設備，而且儀器環境輕微震動會導致光學檢測結果出現較大偏差。VANNII 等[22]研究發現肺癌患者血液外泌體來源的miR-25 和miR-223 的表達水平較正常人升高，而1et-7f，miR-20b 和miR-30e-3p 的表達水平前者較后者明顯降低，這種差異性表達為肺癌的診斷帶來潛在應用價值。因此，對肺癌患者的外泌體進行檢測，將為肺癌患者的診斷提供更加科學的工具。然而目前針對外泌體miRNA 腫瘤標志物的檢測都是連同正常外泌體miRNA 一起分析的，導致少量的腫瘤外泌體中過表達miRNA 信號常被噪聲淹沒[23]。而外泌體膜表面蛋白反映其來源細胞的特征和狀態，可借助親和結合直接特異檢測，因此發展以腫瘤外泌體表面特異蛋白為靶標的檢測方法具有重要意義。

3.2 以外泌體表面蛋白為靶標的檢測方法進展 傳統檢測方法如蛋白印跡和酶聯免疫法，操作復雜,敏感度極低，不適合臨床推廣[24]。為了解決這些問題，ZONG 等[25]采用磁珠捕獲外泌體，再與結合在納米棒上的探針相結合，利用表面增強拉曼散射檢測腫瘤來源外泌體；ZHAO 等[26]利用微流控芯片實現了外泌體表面多個蛋白的同時檢測；JEONG等[27]采用磁珠直接捕獲血清中的外泌體，利用電化學法分析了多種蛋白質；DOLDAN 等[28]報道了一種基于電化學“三明治”免疫夾心的方法，用來定量檢測外泌體。

核酸適配體（aptamer）具有與抗體相似的高親和性，特異度高，識別能力強，可以特異地將腫瘤外泌體與正常外泌體區分開[29]。XIA 等[30]將針對CD63 蛋白的Aptamer 整合到單壁碳納米管上，利用可視化的比色反應來檢測乳腺癌來源外泌體；ZHOU 等[31]將外泌體CD63 蛋白特異性Aptamer 固定在金電極表面并整合到微流體裝置上，利用電化學生物傳感器定量檢測肝癌外泌體；JIANG 等[32]利用金納米粒子和外泌體競爭性的與Aptamer 結合，導致金納米粒子的聚合或者解聚，從而形成可視化的比色反應來檢測外泌體；CHEN 等[33]基于熒光共振能量轉移Aptamer 傳感，將外泌體固定在上轉換納米粒子和金納米棒之間進行檢測；WANG 等[34]報道了一種增強電化學Aptamer 傳感器，它利用DNA 納米四面體結構捕獲Aptamer，并固定在金電極上，在加入外泌體后發生氧化還原反應，并通過K3[Fe(CN)6]/KCl 覆蓋住整個電極來產生信號放大，納米四面體結構有效地阻止了Aptamer 在電極上容易聚集、纏結的現象，因此在檢測外泌體時可產生更強、更穩定的檢測信號。表1 總結了外泌體的檢測方法。

表1 外泌體表面蛋白檢測方法

4 總結和展望

腫瘤的早期診斷對腫瘤的預后和5年生存率有著重要作用，然而目前的早期診斷技術難以滿足臨床需求。液體活檢技術作為無創的新興的腫瘤檢測方法，在腫瘤的早期診斷、預后監測中都有重大的臨床價值。外泌體與CTC,ctDNA 都屬于液體活檢的重要組成成分，但是外泌體具有分布廣泛、來源于活細胞、分離鑒定相對簡單等優點，受到越來越多的關注。雖然外泌體在腫瘤診斷中有巨大應用價值，但仍存在很大的探索空間。目前外泌體診斷研究的標本量較少，仍需大樣本、多中心的臨床研究。而且外泌體表面蛋白的檢測方法大都是利用親和分子特異性結合后進行檢測，因此在應用該類方法進行臨床檢測時，比腫瘤來源外泌體多很多的正常外泌體會競爭性地占據捕獲分子，導致無法結合腫瘤來源外泌體，而使檢測靈敏度降低，因此如何保證所有腫瘤來源外泌體均能與特異的識別分子結合，對腫瘤的早期篩查具有非常重要的意義。同時將外泌體與腫瘤相關的其他檢測指標聯合檢測，或許能取得更好的診斷效能。