抗幽門螺桿菌尿素酶B納米抗體的制備及鑒定

鐘引鳳，劉曉芳，劉 貝，黃云祥，何慶華，李燕萍，涂 追，劉 瓊，付金衡*

(南昌大學a.生命科學學院，江西 南昌 330031；b.中德聯合研究院，江西 南昌 330047；c.食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；d.基礎醫學院，江西 南昌 330031)

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)是一種螺旋形、微嗜氧、革蘭氏陰性感染性病原體，主要寄生在在人體的胃黏膜上[1]。感染幽門螺桿菌會帶來各種腸胃道疾病，如胃炎、消化性潰瘍、胃癌等[2,4]，世界上一半的人口遭受了幽門螺桿菌的感染[1]。胃中的尿素酶早在20世紀就被發現，且尿素酶被證明具有很高的抗原性被認為是開發預防和治療性幽門螺桿菌感染疫苗的潛在抗原，有證據表明尿素酶是幽門螺桿菌感染患者抗體識別的主要靶點[3]。

目前，基于免疫尿素酶分析檢測幽門螺桿菌感染的大多是多克隆抗體[15]和單克隆抗體[16]、scFV[17]，但這些抗體存在穩定性差、產量少等不足，使用具有分子量低、穩定性好、親和力高、易于基因程改造等優點的納米抗體檢測幽門螺桿菌鮮有報道[5-7]。近年來，納米抗體被廣泛地應用于食品安全檢測、醫學診斷及治療、藥物開發等各個領域[18-21]。現階段，治療幽門螺桿菌感染的常規藥是抗生素，盡管在一些臨床實驗中，抗生素治療表現了積極的效率，但遇到復雜臨床病癥時的真實效率仍無法保證[8]。疫苗是防治幽門螺桿菌感染考慮的策略之一，但鑒于其易在人體內產生免疫耐受，限制了幽門螺桿菌疫苗的應用，同時不同的疫苗策略還會帶來安全性問題[9]。研究者們對納米抗體的深究，使其在疾病診斷及治療領域的應用迅速發展[10-12]。

本研究聚焦抗UreB納米抗體的應用，構建抗UreB納米抗體噬菌體免疫文庫，采用免疫親和淘選，從該文庫中獲得了抗幽門螺桿菌UreB納米抗體，通過基因工程技術獲得了原核表達的納米抗體，并進行了初步功能鑒定。本研究中淘選的抗幽門螺桿菌UreB納米抗體可以利用納米抗體的高特異性和高親和力，建立一系列簡單、便捷、成本低的檢測幽門螺桿菌感染的方法，達到早期預防和診斷的目的。同時也可以將抗幽門螺桿菌UreB納米抗體進行人源化改造，為以后用做抗體藥物治療幽門螺桿菌感染打下良好基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

幽門螺桿菌J99菌液由南昌大學基礎醫學院劉瓊講師惠贈；PCR引物由上海生工合成；EasyGeno快速重組克隆試劑盒購自天根生化科技有限公司；pET25b、噬菌粒載體pComb3XSS、輔助噬菌體M13KO7為實驗室保存。

1.2 主要儀器

穩壓電泳儀(DYY-I Ⅲ)六一儀器廠；酶標儀Thermo公司；超聲破碎儀新芝生物科技股份有限公司；PCR儀器BIO-RAD。

1.3 方法

1.3.1 幽門螺桿菌UreB重組蛋白的表達與鑒定

(1)幽門螺桿菌UreB基因的擴增和TA克隆

根據NCBI上AY714224.1的UreB基因序列和pET25b載體設計引物：UreB-F1：5′-GGAATTCCAAAAAGATTAGCAGAAAAG-3′(EcoRI)

UreB-R1：5′-CCAAGCTTGGGAAAATGCTAAAGAGTTGCGC-3′(HindIII)。以幽門螺桿菌J99菌液為模板，PCR反應條件為94 ℃(預變性)：5 min，94 ℃(變性)：1 min，55 ℃(退火)：1 min，72 ℃(延伸)：2 min，35個循環，72 ℃：10 min。瓊脂糖凝膠電泳分析產物，根據Mighty TA-cloning Kit進行TA克隆，電轉至E.coliDH5α感受態中，菌落PCR驗證克隆并送至擎科生物技術有限公司測序。

(2)重組質粒的構建及表達

分別將UreB基因和pET25b載體用EcoRI和HindIII雙酶切酶連后電轉至E.coliDH5α感受態中，菌落PCR驗證克隆并測序。將序列正確的陽性克隆電轉至E.coliRosetta感受態細胞中，涂布在2×YT-amp平板中，取單個菌接于5 mL LB-amp液體培養基中，37 ℃，220 r·min-1過夜培養按1%接種于50 mL LB-amp液體培養基中，220 r·min-137 ℃培養至OD600為0.4左右，加入0.2 mmol·L-1IPTG 25 ℃誘導表達4 h，收集菌體，超聲破碎后收集上清和沉淀，SDS-PAGE鑒定。

(3)重組蛋白的變性、純化及復性

收集目的蛋白包涵體沉淀，用包涵體洗滌液(50 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0，100 mmol·L-1NaCl，1 mmol·L-1EDTA，0.5% Triton X-100)洗3次，加入適量體積的變性液(50 mmol·L-1Tris-HCl，pH8.0，100 mmol·L-1NaCl，1 mmol·L-1EDTA，10 mmol·L-1DTT，8 mol·L-1尿素)，4 ℃，水平搖床放1 h，離心取上清，Ni-柱純化，將含目的蛋白且純度較高的洗脫液，每間隔4 h加入等體積的包涵體復性液(50 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0，100 mmol·L-1NaCl，1.5 mmol·L-1GSH，0.3 mmol·L-1GSSG，0.5 mol·L-1精氨酸)以逐步稀釋尿素濃度，再經10 kDa微量透析管透析,測蛋白濃度蛋白定量。

1.3.2 羊駝免疫及血清效價測定

將4×108cfu滅活的HpJ99菌與相同體積弗氏完全佐劑乳化后，對羊駝進行皮下多點注射免疫，每隔2周，取2×108cfu滅活的幽門螺桿菌J99菌與等體積弗氏不完全佐劑乳化進行加強免疫，取3次加強免疫的羊駝血測血清效價。方法如下：100 μL濃度為5 μg·mL-1重組蛋白UreB，于4 ℃冰箱中包被12 h；PBST溶液洗滌3次后，4%的脫脂牛奶于37 ℃中封閉1 h；PBST溶液洗滌3次后，梯度稀釋后的羊駝血清于37 ℃中結合30 min；PBST溶液洗滌3次后，加入100 μL 1/5000的HRP標記鼠抗羊駝的抗體稀釋液，于37 ℃孵育30 min；PBST溶液洗滌6次后，加入100 μL TMB單組份顯色液，于37 ℃中顯色10 min；最后加入2 moL·L-1H2SO4終止液，酶標儀測OD450值。

1.3.3 抗幽門螺桿菌納米抗體噬菌體展示文庫的構建

具體方法參考文獻[13]，簡單描述為：從羊駝血液中獲取總RNA，根據Thermo公司的cDNA反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，通過two-step nested PCR方法獲得VHH基因，第一步反應,使用alpVh-LD(5′-CTTGGTGGTCCTGGCTGC-3′)和CH2-R(5′-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3′)一對引物，擴增出約700 bp的VH域；第二步反應，使用VHH-1(5′-CATGCCATGACTGTGGCCCAGGCGGCCCAGKTGCAGCTCGTGGAGTC-3′)和VHH-2(5′-CATGCCATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCATGGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG-3′)或VHH-3(5′-CATGCCATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCGTCTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG-3′)兩對引物PCR出約500 bp的VHH基因。分別用SfiI酶切VHH基因和噬菌粒載體pComb3XSS，酶連后轉化至E.coliTG1感受態里，過夜固體培養后，以1/20的感染復數感染M13KO7輔助噬菌體，建抗Hp UreB納米抗體的噬菌體文庫，并通過插入率和庫容及多樣性鑒定評估文庫質量。

1.3.4 抗Hp納米抗體噬菌體展示文庫的淘選

采用固相免疫親和淘選，以重組蛋白UreB為抗原，從建的納米抗體噬菌體庫中篩選出能特異性結合UreB的納米抗體。具體方法參照文獻[14]，按表1條件進行三輪篩選，每一輪篩選后，取10 μL洗脫物測滴度，剩余洗脫物擴增后用于下一輪的篩選。

表1 淘選條件

1.3.5 間接phage-ELISA鑒定陽性克隆

分別從第2、3輪洗脫物測滴度的平板上(選取菌落數100～300個的平板)，隨機挑取48個克隆子，進行單個噬菌體克隆的救援[14]，根據OD450樣本值/OD450陰性對照值≥2時，視為陽性克隆，并進行特異性驗證及測序。

1.3.6 抗重組幽門螺桿菌UreB納米抗體的原核表達

(1)表達載體pET25b(+)-HU2-9、pET25b(+)-HU2-36的構建

分別以pComb3XSS-HU2-9、pComb3XSS-HU2-36質粒為模板，根據EasyGeno快速重組克隆試劑盒說明書設計擴增VHH基因的F′(5′-AGCCGGCGATGGCCATGCAGGTGCAGCTCGTGGATGC-3′)和R′(5′-ATCTCGAGTGCGGCCGCCTGGCCGGCCTGGCCGTCTTG-3′)引物，PCR擴增出VHH基因，表達載體pET25b(+)進行NcoI和NotI雙酶切，按EasyGeno快速重組克隆試劑盒說明書配制連接體系，混合反應液置于50 ℃反應15 min，瞬時離心并置于冰上冷卻，鈣轉至Rosetta(DE3)感受態細胞中，涂布于2×YT-amp平板篩選陽性克隆，隨機挑取克隆子進行菌落PCR驗證并測序。

(2)抗重組幽門螺桿菌UreB納米抗體誘導表達與純化

將陽性克隆培養至OD600約0.5時，在30 ℃，220 r·min-1，加入終濃度為0.1 mmol·L-1IPTG搖床培養6 h后，收集菌體，超聲破碎后將含有目的蛋白的上鎳柱純化，SDS-PAGE鑒定蛋白純度。

1.3.7 間接ELISA鑒定抗重組幽門螺桿菌UreB納米抗體結合Hp的活性

具體方法參考文獻[14]，簡單概括為包被3 μg·mL-1的幽門螺桿菌全菌蛋白，結合時加入不同濃度的納米抗體，測OD450，根據OD450樣本值/OD450空白對照值≥2時，即認為納米抗體在該濃度下具有結合幽門螺桿菌的能力。

1.3.8 抗重組幽門螺桿菌UreB納米抗體抑制尿素酶活性鑒定

具體方法參考文獻[4]，通過在一定時間內，測定CO2濃度的變化，評估納米抗體中和幽門螺桿菌尿素酶活性的能力，即體外培養幽門螺桿菌至109cfu，然后與不同濃度的納米抗體于4 ℃下孵育16 h，加入100 μL 500 mmol·L-1尿素和0.2 g·L-1的酚紅混合液于37℃下孵育3 h，在這3 h內，每30 min，測定OD550，通過公式計算抑制率。

2 結果與分析

2.1 幽門螺桿菌UreB重組蛋白的表達與鑒定

2.1.1 幽門螺桿菌UreB基因的擴增

利用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴增產物，凝膠成像系統顯示在大約1 700 bp左右有一條清晰的條帶，其大小與幽門螺桿菌UreB基因理論分子量大小(1 710 bp)相近，成功擴增到幽門螺桿菌UreB基因片段，具體見圖1。

M:DNA marker,1:PCR產物UreB。

2.1.2 幽門螺桿菌UreB蛋白表達及純化

重組pET25b-UreB質粒，電轉至E.coliRosetta感受態細胞中，0.2 mmol·L-1IPTG誘導表達純化后，SDS-PAGE電泳鑒定誘導后的表達情況，從圖2可得UreB基因在該原核表達系統中表達，UreB重組蛋白分子量大小約66 kDa與理論值相符，復性后獲得高純度的目的蛋白。

2.2 羊駝免疫后血清效價的測定

將滅活的幽門螺桿菌J99菌株免疫羊駝4次，分別取第2，3，4次免疫羊駝后的血清并以免疫之前的血清作為陰性對照，倍比稀釋免疫羊駝前后的血清，以重組蛋白UreB為抗原，間接ELISA法測效價如圖3所示。隨著免疫次數的增加免疫反應隨之增強，特異性的抗體增多，菌體展示文庫，有利于淘選出特異性好、親和力高的納米抗體。

M:蛋白marker；1～4:復性前用不同濃度咪唑洗脫的蛋白；5:復性后重組蛋白UreB。

K

2.3 抗幽門螺桿菌納米抗體噬菌體展示文庫的構建

采取羊駝血30 mL，提取總RNA，如圖4(a)所示，可清晰的看到總RNA的18S和28S兩條帶。兩步巢式PCR擴增VHH基因，第一步巢式PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定如圖4(b)所示，750 bp左右出現長鉸鏈重鏈抗體編碼的可變區基因。第二步反應以第一步回收純化后的產物作為模板進行擴增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增產物如圖4(c)所示。

(a):提取的總RNA,M:DNA marker DL2000,1:總RNA；(b):第一輪巢式PCR,M:DNA marker,1-2:兩對引物的PCR產物,目的條帶約為750 bp；(c):第二輪巢式PCR,M:DNA marker；1-2:兩對引物的PCR產物，目的條帶約為750 bp。

在450 bp左右出現與預期擴增的VHH片段大小相符的條帶，純化PCR產物將其與噬菌粒載體pComb3XSS分別進行SfiI酶切，T4 DNA酶連接后電轉至E.coliTG1感受態中，37 ℃固態過夜培養，隨機挑24個單菌落進行菌落PCR驗證，如圖5(a)所示，在650 bp左右有條帶，計算得VHH基因插入率為87.5%，將陽性克隆送測序，多序列比對結果如圖5(b)所示，21個陽性克隆的基因均為編碼VHH的基因序列抗體庫的有效庫容達到4.68×107cfu。

2.4 抗幽門螺桿菌納米抗體噬菌體展示文庫的淘選

以重組蛋白UreB為靶分子，經過3輪固相親和淘選，每輪以“吸附-洗滌-洗脫-擴增”為主要步驟，逐輪降低靶分子包被濃度、文庫投入量，增加洗滌次數來富集特異性結合UreB的納米抗體，結果如表2所示，噬菌體克隆得到有效富集。

表2 各輪淘選中結合UreB的噬菌體克隆的滴度和富集度

(a):菌落PCR,M:DNA marker；1-24:隨機挑選的菌落；(b):alignment的比對序列。

2.5 間接phage-ELISA鑒定陽性克隆

通過間接ELISA檢測從測洗脫噬菌體滴度的平板上隨機挑取的48個噬菌體克隆救援后的上清[14]，根據OD450樣本值/OD450陰性對照值≥2即為陽性噬菌體，選取吸光度較高的11個陽性噬菌體進行交叉實驗，結果如圖6所示11個陽性噬菌體特異性都較好。序列測定后，采用alignment軟件進行多序列對比分析，得到了6種不同的獨特納米抗體基因序列，序列分析發現HU2-9和HU2-36 CDR3區長度適中且無半胱氨酸易表達，故用這兩個納米抗體進行后續實驗。

2.6 納米抗體的原核表達

2.6.1 表達載體pET25b(+)-HU2-9、pET25b(+)-HU2-36的構建陽性克隆的菌落PCR鑒定結果如圖7所示，在750 bp處出現目的條帶，陽性克隆測序結果表明，表達載體pET25b(+)-HU2-9、pET25b(+)-HU2-36構建成功。

Phage Clones

M:DNA marker；12:HU2-9重組克隆；13-22:HU2-36重組克隆；23:陰性對照；24:空白對照。

2.6.2 納米抗體的表達與純化

將重組表達載體轉化至E.coliRosetta(DE3)感受態細胞，0.1 mmol·L-1IPTG誘導表達6 h，超聲破碎后收集上清，Ni柱純化后SDS-PAGE鑒定純化效果，結果如圖8表明，在20 kDa處有蛋白條帶，符合目的蛋白分子量大小，經BCA方法定量后，算出重組蛋白表達量分別為92和32 mg·L-1。

M:蛋白marker,1-3:分別為20 mmol·L-1咪唑、300 mmol·L-1咪唑、500 mmol·L-1咪唑下洗脫的HU2-9蛋白；4-6:分別為20 mmol·L-1咪唑、300 mmol·L-1咪唑、500 mmol·L-1咪唑下洗脫的HU2-36蛋白。

2.7 納米抗體HU2-9、HU2-36結合幽門螺桿菌的活性分析

間接phage-ELISA分析表達的納米抗體活性，以破碎的幽門螺桿菌全菌蛋白為檢測抗原，分別測定不同濃度的納米抗體HU2-9和HU2-36結合幽門螺桿菌的活性，根據OD450樣本值/OD450空白對照值≥2即認為具有結合幽門螺桿菌全菌蛋白的能力，結果如圖9表明，只有納米抗體HU2-9在濃度為112.5 μg·L-1時，才能與幽門螺桿菌全菌蛋白結合。

2.8 納米抗體HU2-9、HU2-36中和幽門螺桿菌尿素酶活性分析

不同濃度的納米抗體與109cfu幽門螺桿菌J99菌株孵育，通過檢測一定時間內，CO2濃度的變化，分析抗UreB納米抗體抑制尿素酶活性的影響，如圖10所示，當納米抗體濃度在30 μg·mL-1時，通過計算HU2-9、HU2-36抑制率分別為18.7%，15.6%，跟Leila Safaee Ardekani淘選出的納米抗體在30 μg·mL-1，抑制率為25%相比具有一定的差異[15]。

Nanobody Concention/(μg·mL-1)

Nanobody Concention/(μg·mL-1)

3 討論

本研究通過將滅活的HpJ99菌皮下多點注射免疫羊駝，經過4次免疫成功地構建抗UreB納米抗體噬菌體免疫文庫，利用固相免疫親和淘選，從文庫中成功得淘選出了6種不同序列的抗幽門螺桿菌UreB納米抗體。用基因工程技術成功構建了pET25b(+)原核表達載體，經金屬Ni螯合層析柱純化獲得了較高純度的可溶性重組蛋白。通過間接ELISA對納米抗體中和幽門螺桿菌尿素酶活性分析，發現納米抗體能夠一定程度地抑制幽門螺桿菌。本研究中淘選的抗幽門螺桿菌UreB納米抗體可以利用納米抗體的高特異性和高親和力，建立一系列簡單、便捷、成本低的幽門螺桿菌感染的檢測方法，達到早期預防和診斷的目的。同時也可以將抗幽門螺桿菌UreB納米抗體進行人源化改造，為以后用做抗體藥物治療幽門螺桿菌感染打下良好基礎。