ERK信號通路介導的EP300過表達在苯腎上腺素誘導小鼠心肌細胞肥大中的作用*

黃麗欣，彭波輝，彭 昌△，馮玉松，羅孝美，吳書琪，張煥婷

（遵義醫科大學1附屬醫院兒內一科，2第一臨床學院，3基礎醫學院生理教研室，貴州遵義563000）

病理性心肌肥厚是引起心臟衰竭和心源性猝死的重要原因。近年來病理性心肌肥厚發病率呈逐漸上升趨勢，且防治措施尚不完善［1］，因此尋找新的治療手段成為當前的研究熱點。本課題組前期研究證實組蛋白乙酰化修飾失衡參與了苯腎上腺素（phenylephrine，PE）所致的病理性心肌肥厚，且進一步證實組蛋白乙酰化酶抑制劑漆樹酸（anacardic acid，AA）能夠逆轉PE所致的心肌肥厚［2］，但該過程的上游信號通路并不清楚。細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）是MAPKs家族中的一個主要成員［3］。研究顯示，ERK通路在細胞分化、增殖、應激反應和細胞凋亡中起著重要調節作用，且該通路可通過上調組蛋白H3乙酰化水平，參與酒精暴露所致的心臟發育相關基因過表達，提示該通路可能與組蛋白乙酰化修飾失衡介導的心肌肥厚相關［4］。因此，本研究應用PE誘導小鼠心肌細胞肥大模型，探討ERK信號通路在組蛋白乙酰化酶抑制劑AA改善PE誘導的小鼠心肌細胞肥大中的作用，為心肌肥厚的防治提供參考資料。

材料和方法

1 實驗動物

選取SPF級新生3 d的健康昆明小鼠120只，體重2.3～2.7 g，雌雄不限，由重慶醫科大學動物中心提供，動物許可證號為SYXK（渝）2012-0015。

2 主要試劑與儀器

ERK抑制劑U0126、膠原酶Ⅱ和PE（Sigma）；胎牛血清（Gibco）；抗ERK及p-ERK單克隆抗體（Cell Signaling Technology）；抗第9位賴氨酸乙酰化的組蛋白H3（acetylated histone H3 at lysine 9，H3K9ac）、β-肌球蛋白重鏈（β-myosin heavy chain，β-MHC）和E1A結 合 蛋 白p300（E1A-binding protein p300，EP300）單克隆抗體及兔IgG多克隆抗體（Abcam）；抗Alexa Fluor 488熒光標記的山羊抗小鼠IgG熒光Ⅱ抗（中杉金橋生物技術有限公司）；抗α-actin及HRP標記的Ⅱ抗（Proteintech）；Trizol總RNA提取試劑（BioTeke）；SDS-PAGE凝膠試劑盒（Beyotime）；免疫共沉試劑盒（Beaver）。

3 主要實驗方法

3.1 心肌細胞原代培養選取出生3 d的昆明小鼠，在超凈工作臺上用無菌鑷子及眼科剪取出心臟，輕柔擠出心臟中的血，預冷PBS液洗凈殘血，將其剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的碎塊，加入少許0.05%膠原酶Ⅱ反復吹打消化2 min，放置沉淀后，棄上清液，如此反復，直至消化完全。將收集的上清液離心（240×g、10 min），棄上清，沉淀與4 mL含20%胎牛血清的DMEM培養液重懸后接種到25 mL培養瓶中，在培養箱（37℃、5%CO2）中差速培養90min后，將細胞懸液轉移至新的培養瓶中，加入終濃度為0.1 mmol/L的BrdU后繼續培養。

3.2 實驗分組及細胞干預各組藥物濃度參照文獻［5-7］選取，采用PE干預心肌細胞48 h構建心肌細胞肥大模型后，按隨機數字表法將心肌細胞分為正常（normal）組（不給予任何處理）、生理鹽水（normal saline，NS）組（給予等量NS處理細胞）和PE組（用100 μmol/L PE干預心肌細胞48 h），探討PE干預的小鼠心肌細胞中EP300和H3K9ac的表達水平及其相互調控關系。再將心肌細胞分為NS組、溶劑對照（DMSO+PE）組（用100μmol/L PE加等體積的DMSO處理心肌細胞）、PE組、AA+PE組（用50μmol/L AA處理后加入100μmol/L PE處理心肌細胞）、U0126+PE組（用10μmol/L U0126干預后加入100μmol/L PE處理心肌細胞）和AA+U0126+PE組（用50μmol/L AA孵育心肌細胞30 min后，再加入10μmol/L U0126處理，最終用100μmol/L PE干預心肌細胞48 h），進一步探討ERK信號通路介導的EP300過表達在PE誘導小鼠心肌細胞肥大中的作用。

3.3 Western blot檢測提取心肌細胞蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度，SDS-PAGE分離蛋白，轉膜，將PVDF膜浸泡于封閉液中，分別加入兔來源單克隆抗體H3K9ac、EP300、β-MHC、ERK和p-ERK，4℃搖床孵育過夜，TBST洗滌，每次5 min，洗滌6次，然后加入Ⅱ抗孵育，搖床上孵育1 h，TBST洗滌，每次5 min，洗滌6次，使用化學發光試劑發光顯影。采用Bio-Rad圖像分析儀進行圖像掃描；應用Quantity One 4.4軟件進行分析。

3.4 RT-qPCR檢測引物用Primer Premier 5.0軟件設計由寶生物公司合成。將β-MHC產物進行梯度稀釋，運用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀擴增，做出標準曲線，得到R2值和擴增效率。β-MHC的上游引物序列為5′-CAAAGGCAAGGCAAAGAAAG-3′，下游引物序列為5′-GCAGAGGCACCAAAATGAAT-3′，產物大小為113 bp；β-actin的上游引物序列為5′-CCTTTATCGGTATGGAGTCTGCG-3′，下游引物序列5′-CCTGACATGACGTTGTTGGCA-3′，產 物 大 小 為289 bp。反應條件為：94℃30 s；94℃5 s，60℃30 s，40個循環。以β-actin作為內參照，所得數據用PCR儀自帶的基于Pfaffl原理的相對定量數據分析軟件處理。

3.5 免疫共沉淀移去培養液，PBS清洗，用結合緩沖液（含蛋白酶抑制劑）裂解細胞，充分混勻后置于冰上孵育10 min，低溫（4℃）20 000×g離心10 min，收集上清。將磁珠預處理后，分別加入EP300抗體和H3K9ac抗體，室溫翻轉20 min，棄上清，加入緩沖液洗滌2次后，加入抗原4℃翻轉孵育過夜。將抗原吸附后的磁體/抗體/抗原復合物經磁性分離，再洗滌，棄掉上清，加入5×SDS-PAGELoading Buffer混合均勻，95℃加熱5 min，室溫下18 000×g離心10 min，收集上清液進行Western blot檢測。

3.6 免疫熒光檢測制作細胞爬片，吸出細胞培養液，PBS洗滌，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌，每次5 min，洗滌3次，0.3%Triton X-100室溫孵育15 min，PBS洗滌，每次5 min，洗滌3次，室溫下山羊血清封閉30 min，加入抗α-actin（1∶50）4℃孵育過夜，PBS洗滌3次，每次5 min，Alexa Fluor 488標記的山羊抗小鼠IgGⅡ抗（1∶1 000），室溫避光孵育1.5 h，PBS洗滌3次，每次5 min，再加入抗EP300Ⅰ抗4℃孵育過夜，PBS洗滌3次，每次5 min，孵育Ⅱ抗，室溫避光孵育1.5 h，PBS洗滌3次，每次5 min，DAPI染核5 min，PBS洗滌3次，每次5 min，抗熒光淬滅劑封片，于熒光倒置顯微鏡下觀察，應用Image-Pro Plus專業圖像分析軟件分析。

4 統計學處理

所有數據用均數±標準差（mean±SD）表示，采用SPSS 18.0統計軟件進行統計學分析。多組間比較采用單因素方差分析，組間均數比較應用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 PE干預的小鼠心肌細胞中EP300和H3K9ac的表達水平及其相互調控關系

Western blot結果顯示，在培養的小鼠心肌細胞中，PE組EP300和H3K9ac表達水平顯著高于NS組（P＜0.05），見圖1A、B。免疫共沉淀結果顯示，EP300可特異性與H3K9ac相互結合，見圖1C。

2 各組小鼠心肌細胞中ERK和p-ERK的表達水平

Western blot結果顯示，在培養的小鼠心肌細胞中，ERK表達水平在各組心肌細胞中無顯著差異（P＞0.05），而p-ERK的表達水平在PE組顯著高于生理鹽水對照組（P＜0.05）；而ERK抑制劑和AA干預組的p-ERK水平均顯著低于PE組（P＜0.05），見圖2。

3 各組小鼠心肌細胞中H3K9ac水平

Western blot結果顯示，在小鼠心肌細胞中，PE組H3K9ac水平顯著高于NS組（P＜0.05）；而ERK抑制劑和AA干預組H3K9ac的水平均顯著低于PE組（P＜0.05），見圖3。

4 各組小鼠心肌細胞中組蛋白乙酰化酶EP300的表達水平

免疫熒光及Western blot結果表明，在培養的小鼠心肌細胞中，PE組EP300表達水平顯著高于NS組（P＜0.05）；AA及ERK抑制劑干預組EP300的表達水平顯著低于PE組（P＜0.05），見圖4。

5 ERK信號通路在AA逆轉PE誘導心肌肥大標志物β-MHC過表達中的作用

RT-qPCR及Western blot結果顯示，PE組心肌肥大標志物β-MHC的mRNA水平及蛋白水平均顯著高于NS組（P＜0.05），ERK抑制劑及AA干預組β-MHC的mRNA及蛋白水平均顯著低于PE組（P＜0.05），見圖5。

討 論

心肌肥厚是心肌細胞對各種刺激因素所產生的適應性反應，分為生理性肥厚和病理性肥厚，病理性心肌肥厚主要表現為心肌細胞體積增大和心肌間質增生，是導致慢性心力衰竭和心源性猝死的獨立危險因素［8］。本課題組前期研究證實組蛋白乙酰化修飾失衡參與了PE誘導的小鼠心肌肥厚［9］，而AA能夠抑制組蛋白乙酰化酶（histone acetylases，HATs）介導的組蛋白H3K9高乙酰化進而改善心肌肥厚［10］，且進一步證實P38絲裂原活化蛋白激酶（P38 mitogenactivated protein kinase，P38 MAPK）信號通路參與了AA改善PE誘導的心肌肥厚［11］，但MAPK信號通路家族還包括c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和ERK信號通路，而ERK和JNK信號通路是否參與AA改善PE誘導小鼠心肌肥厚并不清楚。因此，本研究應用PE誘導小鼠心肌細胞肥大，來探討ERK信號通路在EP300介導的組蛋白H3K9ac乙酰化失衡致心肌細胞肥大中的作用。

Figure 1.The expression of EP300 and H3K9ac in the mouse myocardial cells and their mutual regulation.A：the protein levels of EP300；B：the protein levels of H3K9ac；C：co-immunoprecipitation（Co-IP）in cell lysates of mouse myocardial cells exposed to three different experimental conditionswith anti-EP300-protein Gmagnetic beads and immunoblot（IB）with an anti-H3K9ac or anti-EP300 antibody for evaluation of protein expression.Input：positive control；IgG：negative control.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NSgroup.圖1 小鼠心肌細胞中EP300和H3K 9ac的表達水平及其相互調控關系

Figure 2.The protein levels of ERK and p-ERK in the mouse myocardial cells with different treatments.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs NSgroup；#P＜0.05 vs PEgroup.圖2 各組小鼠心肌細胞中ERK及p-ERK的蛋白水平

Figure 3.The level of H3K9ac in the mouse myocardial cells with different treatments.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs NSgroup；#P＜0.05 vs PEgroup.圖3 小鼠心肌細胞中組蛋白H3K9ac水平的比較

Figure 4.The expression of EP300 in the mouse myocardial cells with different treatments.A：the immunofluorescence images of myocardial cells（scale bar=20μm）；B：the EP300 average optical density；C：the protein levels of EP300 were assayed by Western blot.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs NSgroup；#P＜0.05 vs PEgroup.圖4 小鼠心肌細胞中組蛋白乙酰化酶EP300的表達水平

組蛋白乙酰化與基因的活化有著密切關系，而去乙酰化與基因沉默有關，組蛋白乙酰化/去乙酰化失衡在心肌肥厚中發揮著重要作用。組蛋白乙酰化通過HATs介導，HATs在心臟表達的亞型主要包括：EP300、p300/CBP輔助因子（p300/CBP-associated factor，PCAF）、組蛋白乙酰化酶氨合成通用控制蛋白5（general control nonderepressible-5，GCN5）、CREB結合蛋白（CREB-binding protein，CBP）和類固醇受體輔活化子1（steroid receptor coactivator-1，SRC1）［12-13］。EP300能改變染色質結合轉錄因子，松解染色質結構而影響基因表達。EP300/CBP作為一種轉錄輔助激活因子，能與多種轉錄因子互相作用，是介導心肌肥厚的關鍵因子［14］。EP300和CBP共同調控心臟肥厚相關基因過表達，可能在PE誘導的心肌肥大中發揮重要作用。本研究結果顯示，在PE誘導的小鼠心肌肥大細胞中，EP300及組蛋白H3K9ac水平顯著高于生理鹽水對照組，為了進一步證實兩者的關系，我們進一步應用免疫共沉淀驗證，結果表明組蛋白H3K9ac受EP300直接調控。以上結果提示EP300過表達介導的組蛋白H3K9乙酰化修飾失衡可能參與了心肌肥厚發生、發展的病理過程。但是組蛋白乙酰化酶EP300介導的其他組蛋白（如：H3K27ac）修飾是否參與了病理性心肌肥厚過程，需進一步證實。

研究顯示在病理性心肌肥厚大鼠心肌細胞中，ERK磷酸化水平較高，降低其水平可改善心肌肥厚［15］。研究證實ERK在心肌細胞中的下游靶點包括EP300和CBP等［16-17］，表明ERK能夠調控EP300的表達。當ERK受到體內、體外刺激時，經過一系列反應發生磷酸化而激活，進一步誘導肥大相關基因表達。本研究結果證實PE組p-ERK水平顯著升高，與EP300變化水平相一致，但ERK水平并沒有明顯變化，表明ERK并沒有參與PE誘導心肌肥厚的過程，而ERK可能在上述病理過程中發揮了重要作用，同時也提示在PE誘導的心肌肥厚小鼠心肌組織中ERK信號通路處于激活狀態，參與心肌肥厚的信號通路較多，其他信號通路是否在PE誘導的小鼠心肌肥厚組織中也處于激活狀態（如JNK）尚待進一步研究。研究證實PE所致的心肌細胞肥大中MEF-2和β-MHC會顯著升高［18］，β-MHC是常用的心肌肥厚標志物，在心臟收縮功能中起著重要的作用，因此我們進一步檢測了β-MHC的轉錄水平及蛋白水平。結果顯示，PE組小鼠心肌細胞肥大標志物β-MHC mRNA水平及蛋白水平均顯著升高，表明β-MHC是判斷PE誘導心肌細胞肥大的重要標志物之一。為進一步證實ERK信號通路對EP300介導的組蛋白H3K9ac乙酰化失衡在PE誘導小鼠心肌細胞肥大中的作用。本實驗應用ERK抑制劑U0126及組蛋白乙酰化酶抑制劑AA干預PE處理的小鼠心肌細胞，結果表明分別經過上述兩種抑制劑干預后的小鼠心肌細胞中p-ERK、H3K9ac、β-MHC及EP300表達水平與單純PE處理組相比均顯著降低，進一步提示我們ERK信號通路參與的EP300介導的組蛋白乙酰化失衡參與了PE誘導的小鼠心肌細胞肥大。

綜上所述，ERK信號通路在EP300介導的組蛋白H3K9ac乙酰化失衡致PE誘導小鼠心肌細胞肥大中扮演著重要的角色，提示ERK信號通路可能成為心肌肥厚防治的新靶點。