PPARγ在結核分枝桿菌感染小鼠脂質代謝中的作用*

趙曉杰，韓曉群，鄧 琴，楊 婧，周智興，劉冬梅，王海利

（宜春學院1化學與生物工程學院，2醫學院醫學免疫與微生物學教研室，江西宜春336000）

結核病是由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的、嚴重危害人類健康的呼吸道傳染病。目前盡管在監測和治療肺結核方面做出了持續和廣泛的努力，但全球每年仍有約20億人感染MTB，100多萬人死于結核病及其并發癥［1］。因而，探索針對細菌和宿主的治療方法以阻止MTB感染和進展為活動性結核病迫在眉睫。

MTB在宿主體內可通過調節多種基因表達，進而調節機體的脂質代謝和炎癥反應，從而為其適應細胞內的生活方式提供條件［2］，其中過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptorγ，PPARγ）便是在脂質代謝調節中發揮重要作用的胞內誘導基因之一。PPARγ是一種配體激活的轉錄因子，與視黃醇X受體（retinoid X receptor，RXR）形成異二聚體，通過與靶基因啟動子區的特異性PPAR反應元件（PPAR-response elements，PPRE）結合，調控多種基因表達［3］，使其成為一種穩定的葡萄糖穩態和脂質代謝的調節劑，參與了腫瘤的發生發展［4］、細胞分化［5］、脂質代謝［6］和炎癥反應［7-8］等多種病理生理過程［9］。

研究證實，MTB感染巨噬細胞中PPARγ的表達在脂質聚集中發揮重要作用［10］，而脂質聚集有助于細胞內MTB的存活和/或復制［11］，但其作用是否通過PPARγ依賴途徑及其機制尚未闡明。另外，PPARγ的抑制在體內MTB感染過程中能否增強機體對胞內病原體的清除作用尚無體內研究予以證實。因此，本研究通過探討PPARγ對MTB感染小鼠機體脂質代謝及肺組織損傷的影響及機制，為揭示MTB的致病機理提供重要線索，為結核病的防治提供新的理論依據。

材料和方法

1 實驗材料

1.1 實驗用菌株與實驗動物MTB標準株H37Rv由中國藥品生物制品檢定所提供。細菌在含有馬鈴薯、蛋黃、孔雀綠的羅氏培養基中培養至對數期，無菌濾過，調整單細胞懸液菌濃度為5×109CFU/L，分裝凍存于-80℃低溫冰箱備用。

6～8周齡SPF級C57BL/6雄性小鼠60只，體重18～20 g，購自三峽大學動物實驗中心。動物在感染前1周進入生物安全Ⅲ級實驗室。

1.2 主要試劑Trizol試劑購自北京艾德萊生物科技有限公司；SYBR Green Master Mix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；高效RNA-cDNA試劑盒購自Applied Biosystems；總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）ELISA檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；油紅O購自Sigma；抗CD36抗體購自Abcam。

2 方法

2.1 實驗分組及處理方法實驗分4組：（1）對照（control）組：尾靜脈注射PBS；（2）MTB組：尾靜脈注射MTB菌液，感染劑量為5×105CFU；（3）MTB+羅格列酮（rosiglitazone，ROZ）組：注射MTB前3 d，給予ROZ灌胃，劑量為4 mg·kg-1·d-1，注射MTB后1 h再給予當天的羅格列酮灌胃，以后按照計劃劑量（4 mg·kg-1·d-1）給予灌胃；（4）MTB+GW9662組：注射MTB后1 h，給予腹腔內注射GW9662，劑量為4 mg/kg，以后按照計劃劑量（4 mg·kg-1·d-1）給予GW9662腹腔注射。按照以上分組方法處理小鼠6周后，禁食12 h，斷頭采血，離心分離血漿，置于-80℃冰箱保存。取小鼠部分肺組織置于-80℃冰箱保存備測PPARγ表達，剩余肺組織進行油紅染色、荷菌量檢測及病理分析。

2.2 肺組織荷菌量檢測嚴格無菌條件下取各組小鼠肺組織充分漂洗，加入生理鹽水1mL，用組織勻漿器研磨制備組織懸液，取0.1mL以生理鹽水作10倍倍比稀釋，取各稀釋度的組織稀釋液100μL接種于羅氏斜面培養基，37℃培養4周后進行菌落計數。取每個斜面上的菌落數在5～50 CFU范圍內的稀釋度進行組織荷菌量計算。

2.3 HE染色觀察肺組織的病理變化取各組小鼠部分肺組織，用4%多聚甲醛固定液固定24h，經過梯度乙醇脫水后進行石蠟包埋、切片及脫蠟、HE染色，光學顯微鏡下觀察肺組織病理變化。

2.4 RT-qPCR檢測肺組織PPARγ的mRNA表達取-80℃冰箱中保存的新鮮冰凍肺組織制成組織勻漿，按照文獻報道的方法［12］，采用RT-qPCR檢測肺組織PPARγ的mRNA表達。引物序列如表1所示。以β-actin為內參照，相對表達量采用2-ΔΔCt法進行計算。mRNA水平用β-actin表達的相對量進行標準化，結果用2-ΔΔCt方法分析。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.Primer sequences for RT-qPCR

2.5 Western blot檢測肺組織PPARγ的蛋白表達取肺組織100 mg，用RIPA裂解液提取肺組織中的蛋白。按常規操作進行PPARγ的Western blot檢測，蛋白條帶通過化學發光劑顯影，用BandScan分析膠片灰度值，目標蛋白表達量通過β-actin進行校正。

2.6 油紅O染色觀察肺組織內脂質蓄積冰凍切片用甲醛-鈣固定10 min，蒸餾水洗，繼之以60%異丙醇浸洗，油紅O染液染10 min，60%異丙醇分色至背景無色，再次蒸餾水洗。Mayer蘇木素復染數分鐘，PBS浸洗（藍化）3 min。蒸餾水洗后水溶性封片劑封片，顯微鏡下觀察。

2.7 ELISA檢測血漿脂質水平使用TC、TG、LDLC和HDL-C試劑盒，采用ELISA在全自動酶標儀（Thermo Scientific）上進行檢測。

2.8 免疫組化檢測肺組織CD36的表達組織塊經乙醇脫水后經二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片、烤片和脫蠟后，加適量的0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）置于微波爐中進行抗原修復。3%的過氧化氫滴加于切片組織上以阻斷內源性過氧化物酶。加Ⅰ抗后于4℃濕盒中孵育過夜（15 h）。加酶標Ⅱ抗，37℃孵育30 min。每一步操作之間均以0.01 mol/L PBS液沖洗3 min。DAB顯色，蘇木素復染2 min，脫水透明后封片，顯微鏡下觀察。

3 統計學處理

數據使用SPSS 19.0統計軟件進行分析。計量資料采用均數±標準差（mean±SD）表示。多組獨立、正態、方差齊資料組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 MTB感染后小鼠肺組織PPARγ表達的變化

如圖1所示，對照組、MTB組、MTB+ROZ組及MTB+GW9662組之間PPARγ表達的差異均有統計學意義（P＜0.05）。與對照組相比，MTB組、MTB+ROZ組及MTB+GW9662組小鼠肺組織PPARγ的mRNA和蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）；MTB+ROZ組小鼠肺組織PPARγ表達顯著高于MTB組，MTB+GW9662組小鼠肺組織PPARγ表達則較MTB組顯著降低（P＜0.05）。

Figure 1.Expression of PPARγat mRNA and protein levels in the lung tissue of mice in each group.A：the mRNA expression of PPARγin the lung tissue of mice in each group；B：the protein expression of PPARγin the lung tissue of mice in each group.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs MTBgroup.圖1 各組小鼠肺組織PPARγ的mRNA和蛋白表達

2 各組小鼠肺組織脂質水平

油紅O染色結果顯示，MTB組小鼠肺組織可見少量橙紅色脂滴；MTB+ROZ組小鼠肺組織內橙紅色脂滴彌漫分布，較單純MTB組明顯增多；而MTB+GW9662組小鼠肺組織內脂滴數量較MTB組明顯減少，見圖2。

Figure 2.Lipid level in the lung tissue of mice in each group（Oil red Ostaining，×400）.圖2 各組小鼠肺組織脂質水平

3 各組小鼠肺組織荷菌量的比較

如圖3所示，MTB組、MTB+ROZ組及MTB+GW9662組之間肺組織荷菌量的差異均有統計學意義（F=13.247，P＜0.05）。與MTB組比較，MTB+ROZ組小鼠肺組織荷菌量明顯升高（6.20±0.58vs6.92±0.21，P＜0.05）；MTB+GW9662組小鼠肺組織荷菌量明顯降低（6.20±0.58vs5.50±0.49，P＜0.05）。

Figure 3.Bacterial load in lung tissue of mice in each group.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs MTB group.圖3 各組小鼠肺組織荷菌量

4 肺組織PPARγ表達與荷菌量相關性分析

相關性分析結果顯示各組小鼠肺組織PPARγ表達與荷菌量對數值呈正相關（r=0.812，P＜0.01），見圖4。

Figure 4.The correlation between PPARγexpression and bacterial load.Mean±SD.n=3.圖4 小鼠肺組織PPARγ表達與荷菌量相關性

5 各組小鼠肺組織CD36表達

免疫組化染色結果顯示，CD36鏡下觀察為棕褐色沉淀。CD36在MTB組呈中等表達，在MTB+ROZ組呈高表達，而在對照組和MTB+GW9662組不表達和呈低表達，見圖5。這表明PPARγ活化能夠增加CD36的表達，而拮抗PPARγ活性則抑制CD36的表達。

Figure 5.Expression of CD36 in lung tissue of mice in each group（×400）.圖5 各組小鼠肺組織CD36表達

6 各組小鼠血漿脂質濃度

如圖6所示，對照組、MTB組、MTB+ROZ組及MTB+GW9662組之間TC、TG、LDL-C及HDL-C的差異均有統計學意義（P＜0.05）。MTB組小鼠血漿脂質水平均明顯低于對照組（P＜0.05）；與單純MTB感染組相比，感染的同時給予PPARγ激動劑羅格列酮和PPARγ拮抗劑GW9662，血漿脂質水平分別表現為明顯下降（P＜0.05）和升高（P＜0.05）。

7 各組小鼠肺組織病理變化

MTB組及MTB+ROZ組小鼠肺組織鏡下均可見肺泡壁增厚、肺組織壞死和出血、炎癥細胞浸潤，后者可見肺泡腔內出現粉紅色滲出液，提示病變更為嚴重；MTB+GW9662組小鼠肺組織鏡下雖然亦可見組織壞死及出血，但病變較輕，見圖7。

討 論

MTB侵入人體后，肺泡巨噬細胞是抵御細菌感染的第一道防線［13］。PPARγ在肺泡巨噬細胞的高表達，在結核病的發病機制中起著關鍵作用。本課題組前期研究顯示，結核病患者外周血單核細胞PPARγ表達高于健康對照組［14］。從本研究結果來看，MTB感染小鼠后，對肺組織造成了一定的結核性損傷，PPARγ的mRNA和蛋白表達均較對照組明顯升高。本研究亦對肝臟和脾臟進行了組織病理學檢測，僅顯示輕度炎癥反應，肝、脾組織PPARγ的mRNA和蛋白表達與對照組相比無顯著差異（結果未在文中列出）。進一步證實PPARγ與結核病發病存在一定的關系。

Figure 6.Lipid concentration in plasma of mice in each group.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs MTBgroup.圖6 各組小鼠血漿脂質濃度

Figure 7.Pathological changes of the lung tissue of mice in each group（left：×40；right：×200）.A：control group；B：MTB group；C：MTB+ROZ group；D：MTB+GW9662 group.圖7 各組小鼠肺組織病理變化

MTB感染期間，慢性炎癥的一個重要特征是由MTB所誘導的泡沫巨噬細胞的積累，這是破壞巨噬細胞中脂質穩態的因素之一，而這些脂質的聚集會影響宿主對感染或細菌清除的反應，并且為細菌的生長提供營養，從而促進細菌生長［15］。結核病患者的干酪性結核肉芽腫中表現出過多的宿主脂質代謝基因表達上調［16］，導致組織中脂質蓄積。本課題組前期研究結果證實了結核病患者PPARγ表達的增加與其血漿脂質水平的變化具有一定的關系［14］。本研究結果顯示，MTB感染小鼠肺組織中可見紅色脂滴形成。有研究報道，MTB感染后通過多種機制誘導肺泡巨噬細胞泡沫化，繼之抑制巨噬細胞膜的修復功能，最終導致其破裂壞死，釋放胞內脂質成分而形成干酪樣壞死［17］，因而推測肺泡巨噬細胞可能是MTB感染肺組織脂質的重要來源。MTB+ROZ組肺組織內橙紅色脂滴彌漫分布，較單純MTB組明顯增多，MTB+GW9662組肺組織內脂滴數量明顯減少。可見，PPARγ的活化能夠加劇MTB所誘導的脂質聚集，而PPARγ拮抗劑GW9662則對MTB所致的脂質聚集具有逆轉作用，表明PPARγ在結核病相關脂質代謝中發揮了重要的作用。

Knight等［18］認為，MTB特異性地激發脂滴的形成，是一種致病策略，目的是建立宿主脂質庫，作為碳源來促進自身在細胞內的生長。MTB優先利用脂質促進多種代謝功能，包括能量合成，毒力因子表達，細胞壁和外膜構建，為自身在宿主體內生長提供有益條件［11］。本研究對小鼠肺組織荷菌量檢測結果顯示，與單純感染MTB相比較，同時給予PPARγ激動劑，小鼠肺組織荷菌量明顯升高，PPARγ拮抗劑則可降低肺組織荷菌量。相關性分析結果顯示，各組小鼠肺組織PPARγ表達與荷菌量呈正相關，也從另一個角度說明了，PPARγ的抑制所致的脂滴耗竭能夠增強機體對胞內MTB的清除。

CD36作為一種識別氧化脂質或氧化凋亡蛋白的B型清道夫受體［19］，介導脂肪酸轉運、吞噬作用和炎癥對各種病原體（包括MTB）的反應。MTB感染能夠促進巨噬細胞CD36的表達。研究發現，PPARγ介導的脂質積聚與麻風病皮損內巨噬細胞中CD36表達增加呈正相關［20］。氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，oxLDL）可以通過激活PPARγ誘導CD36表達［21］。本研究結果顯示，小鼠肺組織CD36在單純MTB感染組呈中等表達，而在感染的同時給予PPARγ激動劑羅格列酮，CD36則呈高表達，PPARγ拮抗劑GW9662則降低了CD36表達，證實了CD36表達確實與PPARγ活化有關。正常情況下，體內肺泡巨噬細胞可通過CD36攝取LDL之間的協作來維持胞內脂質的平衡［16］。正是MTB感染上調了PPARγ的表達，導致下游信號CD36對脂質的過度攝取，引起外源性脂質的流入增加，因而導致MTB感染小鼠肺組織脂質水平的變化。可見，MTB感染過程中，PPARγ可通過調節參與脂質吸收的CD36表達，促進細胞內脂質的積累［22］，但并不排除PPARγ介導的脂質積聚還與其他清道夫受體，如巨噬細胞清道夫受體（macrophage scavenger receptor，MSR）、具有膠原結構的巨噬細胞受體（macrophage receptor with collagenousstructure，MARCO）等表達有關。

近年來有研究發現，結核分枝桿菌依賴機體的脂類來決定其存活或增殖，因此其感染后誘導的機體脂代謝下調是該病原菌致病的主要特點。血液中脂質水平的降低被認為會加速肺部疾病的發展，而且是傳染病的主要危險因素［23-25］。本研究檢測血漿TC、TG、LDL-C和HDL-C濃度，結果顯示PPARγ表達增加或其活化反而降低血脂水平，與PPARγ活化致肺組織脂質增加相反。有理論認為MTB感染產生過氧化作用，可能導致血脂濃度降低和組織炎癥［23］。此外，CD36能夠參與和增加對外源性脂質的攝取［26］，推測血脂降低與PPARγ誘導的CD36表達亦存在一定的關系。

宿主脂質在MTB細胞壁和胞內內含物中積累是MTB維持毒力所必需的［27］。本實驗通過對肺組織病理學觀察顯示，MTB感染過程中，PPARγ活化會導致肺組織出現更嚴重的病理損傷，而這種損傷伴隨著組織中脂滴的積聚，細菌數量的增加以及系統性血清脂質的損耗。因而脂質代謝異常對MTB感染和疾病進展具有一定的促進作用。

總之，本研究探討了PPARγ通過CD36途徑在MTB感染小鼠脂質代謝中的作用，闡明了MTB誘導的PPARγ表達所導致的脂質聚集能夠影響宿主對細菌的清除［28］，有助于MTB在體內的存活和復制，這對MTB來說是一種逃逸宿主免疫反應的機制。從而提示PPARγ和CD36作為脂質代謝的關鍵調節因子，有望成為遏制結核病進展的候選靶標。