miR-155/自噬/外泌體對酒精性肝病的影響*

陳思龍，徐光福，覃詩雨，肖 莉

（三峽大學醫學院，湖北宜昌443002）

酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是由于長期過度飲酒導致的一種慢性肝臟損傷性疾病，其發病率在全球逐年增高［1］，在中國已成為繼病毒感染之后的第二大肝損傷原因。ALD可表現為一系列的病理變化，包括脂肪變性，肝炎、肝纖維化和硬化，甚至導致肝癌的發生［2］。由于其病理機制復雜，目前尚無有效的臨床治療手段和藥物［3］。深入探討ALD的病理機制，具有重要的科學研究意義和臨床應用前景。

肝臟巨噬細胞（即kupffer細胞）的持續過度活化對誘導和推動ALD具有舉足輕重的作用［4］。以巨噬細胞為靶點，抑制ALD中肝臟過度的炎癥反應被認為是治療ALD的重要研究方向［5］。基于腸源性內毒素激活肝內巨噬細胞的作用［6］，使用腸道抗生素和益生菌等［7-8］也對ALD具有一定的治療作用。近年來的研究顯示，外泌體可直接激活ALD中肝臟巨噬細胞，是巨噬細胞過度活化的重要因素［9-10］。但酒精誘導肝臟外泌體生成的相關調節機制仍不明確。

近年來的研究顯示，自噬和外泌體相關分泌途徑之間密切相關［11］。它們共享了許多相同的因素，例如外泌體來源于多泡小體（multivesicular bodies，MVB），自噬體也可以與晚期內囊體或MVB融合，產生自噬內涵體［12］。在外泌體實驗中也發現了許多參與不同自噬過程的蛋白質，例如HSPA8，HSP90AA 1，VCP和Rab7A等。但在ALD中，自嗜和外泌體生成關系尚不明確。本實驗以“miR-155/自噬/外泌體”為主要研究對象，從肝細胞對巨噬細胞活化作用的角度，探討酒精性肝病的病理機制，為藥物治療靶點的開發提供實驗基礎。

材料和方法

1 動物和細胞

8～10周齡雌性C57BL/6N小鼠購自三峽大學實驗動物中心（合格證號：No.42010200002783）。所有動物實驗均經三峽大學動物保護和使用委員會批準，按照國家衛生研究院的指導方針進行。小鼠正常肝細胞AML-12購于ATCC（貨號CRL-2254）。

2 主要試劑

Lieber-DeCarli酒精液體飼料購于南通營養動物飼料高科技有限公司（貨號TP4030D、TP4030C）；ExoQuick Exosome isolation and RNA Purification Kit（貨號EQ806A-1）和去外泌體胎牛血清（貨號EXOFBSHI）購自System Biosciences；兔抗鼠CD63抗體（貨 號DF2305）購 自Affinity Biosciences；佛 波 酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA；貨號P1585）和PKH26（貨號MINI26）購于Sigma Aldrich。

3 主要方法

3.1 動物實驗將C57BL/6N小鼠隨機分為飲食對照（control）組和酒精喂養（ethanol）組，單籠喂養，并將飲食對照組和酒精喂養組小鼠進行等熱量配對喂養［13］，每組10只。酒精飲食的小鼠以含有5%（v/v）乙醇的Lieber-DeCarli液體飼料喂養6周；配對飲食小鼠每日喂飼與酒精飲食小鼠相等熱量的液體飼料。實驗結束時，收集血漿和組織樣本。

3.2 細胞培養AML-12細胞在37°C、5%CO2環境中培養在Dulbecco改良的Eagle培養基（DMEM；Gibco）中，添加1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素和10%去外泌體胎牛血清中。當細胞融合度達到70%～80%時，加入250 mmol/L乙醇培養24 h以誘導細胞損傷。

THP-1細胞在RPMI-1640完全培養基中培養，經PMA（5μg/L）刺激12 h，形成PMA分化的THP-1細胞（簡稱dpTHP-1細胞）。將來源于AML-12細胞的外泌體（28μg/L）與pdTHP-1細胞共培養24 h，收集細胞，檢測相關細胞因子mRNA的表達。

3.3 外泌體的分離與鑒定收集細胞培養基，根據說明書進行外泌體分離（ExoQuick Exosome isolation and RNA Purification Kit）。簡單地說，將10 mL培養基與2 mL ExoQuick外泌體沉淀溶液在4℃下混合過夜，然后在1 500×g下離心30 min，取上清液，得到富含外泌體的部分。將外泌體洗滌2次并重新懸浮在PBS中并在-80℃下儲存。通過透射電鏡和納米粒子跟蹤分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）技術對外泌體的大小、濃度和表面標記物進行了表征。利用NanoSight NS300系統（NanoSight，Amesbury）分析外泌體的濃度和大小分布。每個樣品測量3次。

3.4 組織染色4%中性甲醛固定的肝組織常規制作成石蠟切片或冰凍切片，進行HE染色或油紅染色后顯微鏡下觀察。石蠟切片在進行抗原修復后，與5%山羊血清/0.3%吐溫-20/PBS非特異性結合，并與兔抗鼠CD63抗體（1∶100）在4℃下孵育過夜。洗滌后，用Cy3結合山羊抗兔IgG在室溫下黑暗中孵育1h。經DAPI核染色后，在Olympus BX53顯微鏡下觀察，用IPP6.0軟件進行強度測定。

3.5 顯微鏡檢查用熒光染料PKH26（Sigma）標記肝細胞外泌體，與pdTHP-1細胞在28μg/L的終濃度下孵育12 h，在Olympus BX53顯微鏡下觀察細胞攝取外泌體的情況，并用Cell Sense軟件采集圖像。

3.6 ELISA和生化分析肝組織勻漿（50 g/L）于RIPA緩沖液（含PMSF）中。采用標準化全自動生化分析儀（Rayto）測定血清丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天門冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）活性、甘油三酯（triglyceride，TG）和肝臟總膽固醇（total cholesterol，TC）的水平。為了便于分析，所有小于檢測下限的值都被認為是零。

3.7 Western blot分析肝組織或AML-12細胞使用含PMSF的RIPA緩沖液勻漿，提取總蛋白。等量的蛋白質行SDS-PAGE，并轉移到硝酸纖維素膜上，使用抗LAMP-1和LAMP-2抗體（1∶300；Proteintech）進行Western blot（Bio-Rad公司）檢測。蛋白質條帶掃描后用ImageJ軟件，以GAPDH為內參照進行分析定量。

3.8 RT-qPCR按RNAiso plus試劑盒說明書使用Trizol從小鼠肝組織樣本或AML-12細胞中分離出總RNA，PrimeScript?RTreagent Kit（TaKaRa）進行反向轉錄，擴增cDNA。以GAPDH mRNA或U6的表達為標準，用2-ΔΔCt法計算相對mRNA的表達。其中主要使用的引物序列見表1。

4 統計學處理

采用GraphPad Prism 5軟件進行統計分析及作圖。實驗數據以均數±標準差（mean±SD）表示，對組間差異進行t檢驗（Dunnett-t），以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 慢性酒精攝入導致肝臟損傷

液體酒精飼料喂養C57BL/6N小鼠6周，建立小鼠慢性ALD模型。組織學觀察發現，酒精性飼料導致小鼠肝細胞空泡變性、肝組織的脂質沉積和炎癥細胞浸潤（圖1A、1B）。與配對喂養小鼠相比，喂養酒精的小鼠血清ALT活性顯著升高（P＜0.05，圖1C），肝臟組織甘油三酯的含量增加（P＜0.01，圖1D）。這些結果表明，慢性酒精導致了肝臟損傷。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The primer sequences used for RT-qPCR

Figure 1.The liver injury in ALD mice.A：HE staining（×200）；B：Oil red O staining（×200）；C：serum ALT activity；D：TG content in liver.PF：paired feed group；AF：alcohol feed group.Mean±SD.n=8.*P＜0.05，**P＜0.01 vs PFgroup.圖1 ALD小鼠肝臟損傷情況的觀察

2 慢性酒精攝入誘導肝臟過度的炎癥反應

炎癥反應被認為在ALD的發病機制中起著至關重要的作用［14］。我們檢測了肝臟組織炎癥因子的表達，結果發現，酒精喂養小鼠肝臟TNF-α、IL-1β、NOS-2、F4/80和MCP-1的mRNA表達顯著增加（P＜0.05）。這說明，慢性酒精的攝入可誘導巨噬細胞的過度活化和肝臟炎癥反應的增強。見圖2。

Figure 2.Excessive inflammatory responses in the liver of ALD mice.Relative mRNA expression of TNF-α，IL-1β，NOS-2，F4/80 and MCP-1 in the liver was detected by RT-qPCR.PF：paired feed group；AF：alcohol feed group.Mean±SD.n=8.*P＜0.05，**P＜0.01 vs PFgroup.圖2 ALD小鼠肝臟中發生過度的炎癥反應

3 慢性酒精攝入對小鼠肝臟miR-155/自噬/外泌體的影響

細胞外囊泡的傳遞可以介導細胞之間的通訊［15］。我們發現，與配對飲食組相比，酒精飲食喂養小鼠肝臟CD63（外泌體標志蛋白）的表達顯著增加（圖3A）。在ALD中，酒精誘導肝細胞分泌大量的細胞外囊泡，含有高濃度的CD40L，能直接激活肝臟巨噬細胞［16］。進一步的結果顯示，酒精的暴露明顯地提高了小鼠肝臟CD40L的表達（圖3B）。

近年來的研究表明，細胞外泌體的生成與自噬密切相關。我們檢測肝臟自噬相關蛋白，結果表明，與配對飲食組相比，酒精飲食喂養小鼠肝臟溶酶體相關膜蛋白LAMP1和LAMP2的表達顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），提示酒精會損害肝臟細胞的自噬程序（圖3C）。此外，慢性酒精的攝入可導致肝臟miR-155的表達顯著升高（P＜0.01圖3D）。這些結果提示，酒精可誘導肝臟miR-155的表達，抑制肝細胞自噬，促進肝細胞外泌體的生成，外泌體可直接介導肝臟巨噬細胞的活化。

4 乙醇通過升高AML-12細胞中miR-155的表達導致細胞自噬受損

為了進一步明確酒精對肝細胞的作用，我們使用乙醇刺激AML-12細胞24 h，制備酒精損傷肝細胞體外模型。結果表明，酒精可直接誘導AML-12細胞的miR-155表 達 的 升 高（P＜0.05，圖4A），降 低LAMP1和LAMP2的 表 達（P＜0.05，P＜0.01，圖4B）。

5 乙醇誘導AML-12細胞分泌的外泌體直接介導巨噬細胞的活化

為了明確酒精作用下肝細胞對巨噬細胞的免疫調節作用，我們將AML-12細胞暴露于乙醇中24 h，分離純化細胞外囊泡，電鏡觀察顯示其膜性結構和大小（圖5A）。經NAT分析表明，細胞囊泡的大小在100～150 nm之間，說明其大部分為外泌體（圖5B）。與對照組相比，酒精顯著升高了AML-12細胞外泌體的分泌數量（P＜0.05，圖5C）。

我們將AML-12細胞分泌的外泌體和pdTHP-1細胞共培養，研究外泌體對巨噬細胞的免疫調節作用。結果發現共培養6 h后，就可以觀察到pdTHP-1細胞攝取外泌體的現象（圖5D）。乙醇處理組外泌體刺激pdTHP-1細胞12 h后，細胞內TNF-α和IL-1β的mRNA表達顯著增加，IL-10和CD206的mRNA表達沒有明顯變化（圖5E），提示向M1型巨噬細胞活化的趨勢。然而，來自對照組的外泌體對pdTHP-1細胞的細胞因子表達沒有明顯的改變。

Figure 3.The changes of miR-155-mediated autophagy/exosome expression in ALD mouse liver.A：the expression of CD63 in the liver tissue；B：CD40L in the liver tissue；C：relative protein levels of LAMP1 and LAMP2 in the liver tissue；D：miR-155 in the liver tissue.PF：paired feed group；AF：alcohol feed group.Mean±SD.n=8.*P＜0.05，**P＜0.01 vs PFgroup.圖3 miR-155介導的自噬/外泌體軸在ALD小鼠肝臟中的表達

Figure 4.Ethanol induced impairment of autophagy in AML-12 cells.A：relative expression of miR-155；B：relative protein levels of LAMP1 and LAMP2.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖4 乙醇導致AML-12細胞自噬功能受損

討 論

酒精可誘導肝細胞分泌大量外泌體。在ALD患者［17］和動物模型外周血［18］中可發現，外泌體的數量顯著升高。在體外使用酒精刺激肝細胞發現，外泌體的生成量成倍增加，而且與巨噬細胞相比，肝細胞是ALD中分泌外泌體的主要細胞［18］。對ALD患者外周血中外泌體的研究表明，外泌體中有多種miRNA，其蛋白質［19］及磷脂［20］等的表達均發生了顯著改變。Saha等［21］的實驗表明，使用酒精刺激肝細胞產生的細胞外囊泡（主要為外泌體）可通過HSP90介導巨噬細胞的活化。Verma等［16］的實驗顯示，酒精可誘導肝細胞分泌大量的外泌體，攜帶36種與炎癥相關的蛋白，其中CD40L可直接介導巨噬細胞的活化，加重肝臟的炎癥反應。使用CD40L中和抗體可以顯著的降低外泌體對巨噬細胞的活化作用。以上研究都說明，來源于肝細胞的外泌體是激活肝內巨噬細胞的重要因素。本實驗也顯示，酒精的攝入可導致小鼠肝細胞外泌體表達的增高，體外實驗表明酒精誘導肝細胞分泌的外泌體可直接介導巨噬細胞的激活。但是酒精誘導肝細胞外泌體合成的機制尚不十分清楚。

Figure 5.Immunomodulatory effect of exosomes secreted by ethanol-stimulated hepatocytes on macrophages.A：the morphological change of extracellular vesicle was observed under electron microscope（×10 000）；B：the size and distribution of extracellular vesicles were detected by nanoparticle tracking analysis；C：the numbers of exosomes（PF：paired feed group；AF：alcohol feed group）；D：the intake of exosomes by THP-1 cells（×200）；E：the mRNA expression of TNF-α，IL-1β，IL-10 and CD206.Control-Ex：control exosome；ethanol-Ex：ethanol-treated exosomes.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs PF group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs control-Ex group.圖5 乙醇刺激肝細胞分泌的外泌體對巨噬細胞的免疫調節作用

在酒精性肝損傷中，急性酒精可直接激活肝臟自噬，而慢性酒精的暴露會導致肝臟自噬功能不足，表現為自噬通量受損［22］。慢性酒精攝入時自噬通量的損害與溶酶體功能和生物發生有關。酒精性飼料喂養降低了小鼠肝臟轉錄因子EB［23］，后者是溶酶體生物發生和自噬的主要調節因子。Babuta［24］等的研究也表明，慢性酒精的攝入啟動了肝細胞自噬，但溶酶體功能下調，整體自噬通量是損傷的。同時體外實驗也發現，在肝細胞和巨噬細胞中沉默LAMP1和LAMP2基因，可有效提高外泌體的釋放。本實驗也發現，慢性酒精的攝入可誘導肝細胞外泌體的分泌成倍增加，同時肝細胞LAMP1和LAMP2表達顯著降低，說明溶酶體功能損傷，自噬功能被抑制，提示酒精可能通過調節肝細胞自噬中的溶酶體功能，誘導外泌體的生物合成。但是在ALD中，自噬和外泌體的相互關聯仍需要進一步探索。

miR-155似乎是參與ALD發生和發展的重要途徑的關鍵miRNA［25］，在肝臟炎癥和纖維化中均具有重要的調節作用。ALD患者［26］和實驗研究［27］都證明，酒精暴露后不同細胞群的肝臟或外周血miR-155表達顯著增加。miR-155在巨噬細胞中的高表達可延長TNF-ɑmRNA的半衰期，介導ALD中肝脂肪變性、炎癥和肝細胞死亡［27］。與野生型小鼠相比［28］，酒精喂養后miR-155 KO小鼠肝臟甘油三酯、ALT水平和脂質過氧化水平顯著降低，減輕慢性酒精誘導的肝損傷，這意味著靶向調節miR-155可能具有治療ALD的潛力。已有報道表明miR-155可直接或間接作用于自噬途徑的多種基因，包括mTOR，p62，LAMP1和LAMP2等［29-30］，從而調控細胞的自噬過程。本實驗結果表明，酒精誘導肝細胞miR-155表達的升高，這可能與肝細胞自噬功能受損與關。

我們的研究表明，酒精刺激肝細胞生成大量miR-155，通過抑制LAMP1和LAMP2的表達導致肝細胞自噬功能障礙，誘導肝細胞生成大量外泌體，外泌體通過其攜帶的生物分子可直接介導巨噬細胞的活化，引發級聯炎癥反應，造成肝臟損傷。酒精通過刺激肝臟miR-155介導自噬和外泌體分泌，誘導外泌體及其攜帶的致炎因子釋放的顯著增加，也是ALD中肝臟巨噬細胞持續過度激活的重要因素。