橙皮素通過調(diào)控SIRT1/PGC-1α信號通路保護(hù)急性心肌梗死大鼠*

左新華，朱光旭，劉 巖

（1重慶康華眾聯(lián)心血管病醫(yī)院檢驗科，重慶400000；2河南省人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，河南鄭州450003）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是由于冠狀動脈供血突然嚴(yán)重減少或中斷，從而導(dǎo)致嚴(yán)重急性心肌缺血和缺血性壞死［1］。氧化應(yīng)激反應(yīng)則是影響AMI后心室重構(gòu)的重要病理反應(yīng)，與心肌細(xì)胞凋亡或壞死、心肌細(xì)胞病理性肥大和細(xì)胞外基質(zhì)代謝紊亂密切相關(guān)［2-3］。心肌組織缺血后，會使活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）增加，引起過度的氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成心肌損傷。因此，尋找能夠抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善AMI后心臟重構(gòu)和功能的潛在藥物具有重要的臨床價值。

沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）是一種保守的NAD+依賴性蛋白去乙酰化酶，是過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator-1α，PGC-1α）的上游調(diào)控因子［4］。Naaz等［5］研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素對AMI大鼠的保護(hù)機制與激活SIRT1/PGC-1α信號通路有關(guān)。據(jù)報道，橙皮素（hesperetin）是柑橘果皮中發(fā)現(xiàn)的一種黃酮苷，能抑制AMI后的心臟炎癥反應(yīng)［6］。以往研究表明，橙皮素具有顯著的抗炎、抗氧化和抗凋亡等作用［7］。Wang等［8］研究認(rèn)為，橙皮素是SIRT1激活劑，可改變NF-κB的乙酰化，發(fā)揮對小鼠肝炎的治療作用。然而，橙皮素是否以及如何參與心肌梗死后的氧化應(yīng)激反應(yīng)，目前仍不清楚。因此，本研究采用大鼠AMI模型，探討橙皮素是否通過激活SIRT1/PGC-1α信號通路，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)對心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡作用。

材料和方法

1 動物

SPF級SD雄性大鼠，體質(zhì)量180～220 g左右，購自河南省實驗動物中心，許可證號為SCXK（豫）2017-0001。所有大鼠自由飲食、飲水，清潔級飼養(yǎng)。經(jīng)本院動物倫理委員會批準(zhǔn)，并遵守3R保護(hù)原則進(jìn)行實驗。

2 主要試劑及儀器

橙皮素（純度≥99%）購自北京索萊寶生物科技有限公司；SIRT1/2抑制劑購自Abcam；白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒，以及總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；抗SIRT1、PGC-1α和β-actin的I抗及羊抗兔II抗均購自Cell Signaling Technology。小型動物超聲系統(tǒng)購自VisualSonics；酶標(biāo)儀購自TECAN；光學(xué)顯微鏡購自Nikon；蛋白電泳儀購自北京六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-Rad。

3 實驗方法

3.1 動物模型制備按照文獻(xiàn)［9］的方法，采用冠狀動脈左前降支（left anterior descending coronary artery，LAD）結(jié)扎術(shù)構(gòu)建AMI大鼠模型。首先通過腹腔注射1%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）將大鼠麻醉。仰臥位固定在手術(shù)平臺上，氣管插管輔助通氣。在胸部左側(cè)的第4和第5肋之間切開皮膚，然后鈍性分離，剝離肌肉，露出心臟。在顯微鏡下打開心包，并結(jié)扎在肺動脈圓錐和左心室的連接處。結(jié)扎后，心肌變白。將切口逐層縫合，然后消毒并注射青霉素以防止感染。最后，在心電圖中觀察到ST段持續(xù)升高，伴有Q波和室性心律失常，表明AMI模型已成功制備。假手術(shù)模型的構(gòu)建與AMI模型類似，但不結(jié)扎。

3.2 動物分組及樣本采集將造模成功的AMI大鼠，根據(jù)隨機數(shù)字表法分成模型組、橙皮素組和橙皮素+抑制劑組，每組12只。另取12只大鼠作為假手術(shù)組。橙皮素組和橙皮素+抑制劑組大鼠給予30 mg·kg-1·d-1的橙皮素灌胃干預(yù)［6］，橙皮素+抑制劑組除橙皮素灌胃外，還需靜脈注射SIRT1抑制劑（10 mg/kg）。假手術(shù)組和模型組分別給予等量生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)8周。

3.3 心功能檢測8周后，使用小型動物超聲系統(tǒng)（探頭頻率為20～40 MHz）測定各組大鼠的左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD）、左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular endsystolic diameter，LVESD）、左心室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）和左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

3.4 樣本采集心功能指標(biāo)檢測完成后，采集各組大鼠的外周血，離心取上清，置于-20℃中保存?zhèn)溆谩Ｈ缓髮⒋笫筇幩溃暾〕鲂呐K。從每組中隨機選擇6只大鼠，將心肌組織置于4%的多聚甲醛中固定；另外6只大鼠的心肌組織液氮速凍后，置于-80℃中保存。

3.5 炎癥因子和氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測采用ELISA法檢測各組大鼠血清中IL-6和TNF-α的水平。根據(jù)試劑盒說明書分別對大鼠血清中SOD、GSH-Px和MDA的水平進(jìn)行檢測。

3.6 HE染色觀察大鼠心肌組織的病理變化取出固定在多聚甲醛中的心肌組織，梯度乙醇脫水透明，石蠟包埋，然后將組織切成5μm厚的切片，HE染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察組織的病理學(xué)變化。

3.7 TUNEL法檢測大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡取制備完成的大鼠心肌組織切片，使用TUNEL試劑盒對心肌細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行檢測。凋亡細(xì)胞分布的同一區(qū)域的每個切片都是從5個高倍視野中隨機選擇的。然后，計算每個視野中的平均凋亡細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比，由此計算出細(xì)胞凋亡率（%）。

3.8 Western blot法檢測大鼠心肌組織中SIRT1/PGC-1α通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平取出-80℃中保存的心肌組織，液氮研磨勻漿化，提取組織中的總蛋白，并用BCA蛋白分析試劑盒對蛋白濃度進(jìn)行定量。總蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并在室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h。洗膜，孵Ⅰ抗（抗SIRT1和PGC-1α抗體，稀釋倍數(shù)為1∶1 000），在4℃條件下過夜。洗膜孵Ⅱ抗，在室溫下孵育1 h，曝光顯色，使用凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白的相對表達(dá)量。其中以β-actin為內(nèi)參照。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

本研究所得數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠心臟超聲檢查結(jié)果分析

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠LVESD和LVEDD顯著升高（P＜0.05），LVFS和LVEF顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，橙皮素組大鼠LVESD和LVEDD顯著降低（P＜0.05），LVFS和LVEF顯著升高（P＜0.05）；與橙皮素組相比，橙皮素+抑制劑組大鼠LVESD和LVEDD顯著升高（P＜0.05），LVFS和LVEF顯著降低（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠心臟超聲檢查結(jié)果分析Table 1.Analysis of echocardiographic results of the rats in each group（Mean±SD.n=12）

2 各組大鼠血清中炎癥因子水平和氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較

與假手術(shù)組相比，模型組IL-6、TNF-α和MDA含量顯著升高，SOD和GSH-Px水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，橙皮素組IL-6、TNF-α和MDA含量顯著降低，SOD和GSH-Px水平顯著升高（P＜0.05）；與橙皮素組相比，橙皮素+抑制劑組IL-6、TNF-α和MDA含量顯著升高，SOD和GSH-Px水平顯著降低（P＜0.05），見表2。

3 各組大鼠心肌組織的病理變化的比較

假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞未見明顯變性，排列規(guī)則、清晰，肌絲相對完整，細(xì)胞間隙均勻；模型組大鼠部分心肌組織損傷嚴(yán)重，心肌纖維溶解、部分?jǐn)嗔眩罅啃募±w維排列明顯紊亂，部分細(xì)胞核固縮、核碎裂，心肌毛細(xì)血管擴(kuò)張，心外膜下可見更嚴(yán)重的炎癥細(xì)胞浸潤和心肌組織壞死；橙皮素組可見少量心肌細(xì)胞疏松、水腫、壞死，與模型組相比，部分心肌纖維排列較規(guī)則，炎癥細(xì)胞浸潤較輕，整體形態(tài)較為清晰；橙皮素+抑制劑組局部心肌纖維排列紊亂，伴有少量心肌細(xì)胞變性、壞死和輕度炎癥細(xì)胞浸潤，毛細(xì)血管輕度充血，病變程度明顯重于橙皮素組，見圖1。

表2 各組大鼠血清中炎癥因子水平和氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較Table 2.The serum levels of inflammatory factors and oxidative stress indexes of the rats in each group（Mean±SD.n=12）

Figure 1.HEstaining of myocardial tissues of the rats in each group（×200）.A：sham operation group；B：model group；C：hesperitin group；D：hesperitin+inhibitor group.圖1 各組大鼠心肌組織HE染色結(jié)果圖

4 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡的比較

與假手術(shù)組相比，模型組心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，橙皮素組心肌細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）；與橙皮素組相比，橙皮素+抑制劑組心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），見圖2及表3。

Figure 2.The images of cardiomyocyte apoptosis in infarcted area of rat heart tissue（TUNEL staining，×200）.A：sham operation group；B：model group；C：hesperitin group；D：hesperitin+inhibitor group.圖2 大鼠心臟組織梗死區(qū)的心肌細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果

5 各組大鼠心肌組織中SIRT1/PGC-1α通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較

與假手術(shù)組相比，模型組SIRT1和PGC-1α蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，橙皮素組SIRT1和PGC-1α蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與橙皮素組相比，橙皮素+抑制劑組SIRT1和PGC-1α蛋白水平顯著降低（P＜0.05），見圖3及表3。

討 論

Figure 3.The images of Western blot for determining the protein levels of SIRT1 and PGC-1αin myocardial tissue of the rats in each group.A：sham operation group；B：model group；C：hesperitin group；D：hesperitin+inhibitor group.圖3 各組大鼠心肌組織心肌組織中SIRT1和PGC-1α蛋白表達(dá)的Western blot圖

表3 各組大鼠心肌組織中SIRT1和PGC-1α蛋白表達(dá)水平及心肌細(xì)胞凋亡率的比較Table 3.Comparison of SIRT1 and PGC-1αprotein expression levels in myocardial tissue and cardiomyocyte apoptotic rates of the rats in each group（Mean±SD.n=12）

AMI作為一種重要的心血管疾病，是導(dǎo)致患者死亡的主要原因，也是全球人口死亡的主要原因之一［10］。AMI病理反應(yīng)十分復(fù)雜，包括炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡在內(nèi)等各種發(fā)病機制，會影響AMI后的心室重構(gòu)［11］。Bai等［12］的研究表明，AMI后過度的炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)可導(dǎo)致繼發(fā)性心肌瘢痕增生、纖維化和心肌細(xì)胞凋亡等，并可導(dǎo)致梗死區(qū)組織形態(tài)異常和結(jié)構(gòu)紊亂、功能障礙，最終導(dǎo)致重癥患者心室重構(gòu)不良和死亡。本研究通過LAD結(jié)扎術(shù)構(gòu)建AMI大鼠模型，并用小型動物超聲系統(tǒng)檢測大鼠的心功能，結(jié)果顯示，模型組大鼠LVEDD和LVESD顯著升高，而LVFS和LVEF顯著降低，說明模型組大鼠心功能下降。經(jīng)HE染色觀察模型組大鼠部分大量心肌纖維排列明顯紊亂，部分細(xì)胞核固縮、核碎裂，心外膜下可見更嚴(yán)重的炎性細(xì)胞浸潤和心肌組織壞死，揭示AMI模型構(gòu)建成功。

橙皮素是柑橘果皮中的主要藥理活性成分，其治療作用主要是由于其抗氧化和自由基清除作用［13］；它不但具有抗過敏、抗皮炎和神經(jīng)保護(hù)作用，還可調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)的功能，增強機體對細(xì)菌和微生物的抵抗力，預(yù)防腫瘤［14］和遺傳毒性，并提高其他藥物的生物利用度［15］。在心血管系統(tǒng)中，橙皮素可擴(kuò)張血管，降低血脂，降低毛細(xì)血管通透性和血管脆性［16］。在本研究中，AMI大鼠在橙皮素的作用下，心功能改善，心肌組織炎癥細(xì)胞浸潤減輕，血清中IL-6和TNF-α含量顯著降低，說明橙皮素可抑制AMI大鼠的炎癥反應(yīng)，與前人結(jié)果一致［6］。

在AMI過程中，炎癥反應(yīng)往往都伴隨著氧化應(yīng)激反應(yīng)。氧化應(yīng)激可產(chǎn)生大量ROS，導(dǎo)致抗氧化系統(tǒng)失衡，造成氧化應(yīng)激損傷，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡、壞死，進(jìn)一步加強氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)之間的聯(lián)系［17］。MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，可進(jìn)一步誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，抑制抗氧化系統(tǒng)，加重?fù)p傷。SOD可清除ROS，增強抗氧化系統(tǒng)，保護(hù)心肌細(xì)胞［18］。在本研究中，AMI大鼠中MDA含量升高，SOD和GSH-Px活性降低，心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高，因此我們推測，AMI大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)可能造成心肌細(xì)胞凋亡。Li等［19］的研究發(fā)現(xiàn)，橙皮素可上調(diào)SOD和GSH-Px等抗氧化酶的表達(dá)，發(fā)揮抗氧化的作用。本研究中，橙皮素顯著提高了AMI大鼠體內(nèi)的SOD和GSH-Px活性，降低了MDA水平，表明橙皮素可抑制AMI大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

SIRT1是NAD+依賴的脫乙酰酶家族中高度保守的成員，可通過去乙酰化和激活PGC-1α來保護(hù)心肌細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷［20］。SIRT1/PGC-1α去乙酰化途徑的紊亂可增強氧化應(yīng)激和促進(jìn)線粒體功能障礙［21］。Cui等［22］的研究發(fā)現(xiàn)，促紅細(xì)胞生成素通過SIRT1/PGC-1α去乙酰化，增強線粒體功能，并抑制阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性。白藜蘆醇通過減輕氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙來減輕糖尿病心臟損傷，這與SIRT1對PGC-1α去乙酰化的調(diào)節(jié)有關(guān)［23］。本研究發(fā)現(xiàn)，橙皮素可提高AMI大鼠心肌組織中SIRT1和PGC-1α蛋白水平，而AMI大鼠在橙皮素和SIRT1抑制劑的雙重作用下，心肌組織中SIRT1和PGC-1α蛋白水平較橙皮素組顯著降低，表明橙皮素減輕AMI大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)，可能與激活SIRT1/PGC-1α去乙酰化途徑有關(guān)。

綜上所述，橙皮素可通過激活SIRT1/PGC-1α信號通路，抑制AMI大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而發(fā)揮心臟保護(hù)作用。然而，我們只研究了SIRT1/PGC-1α信號通路的重要作用，其他與氧化應(yīng)激有關(guān)的信號通路尚需后續(xù)進(jìn)一步研究。