D-氨基半乳糖糖基化修飾玉米肽抗疲勞效應的研究

夏春榮 王曉杰 姜宇航 曲 悅 劉曉蘭

(齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江省玉米深加工理論與技術重點實驗室，齊齊哈爾 161006)

疲勞是在同等工作強度下工作一段時間后機體的工作能力下降、能量供應不足的一種狀態[1]。當人體處于疲勞狀態時，如果不及時恢復，逐漸積累，則可能會導致機體內分泌失調、免疫力下降，甚至會誘發疾病[2]。因此，有必要對天然抗疲勞的活性物質進行研究，在不產生不利影響的前提下，改善人類的運動能力，以推遲疲勞并加速消除疲勞[3]。目前，一些疲勞產生的機制學說包括“能量耗竭學說”“代謝產物堆積學說”“自由基學說”等[4]。其中，“自由基學說”近年來引起了越來越廣泛的關注。該學說認為在劇烈運動時，體內自由基生成、脂質過氧化等過程會加速，造成自由基堆積，從而產生更多的氧化活性物質。這些氧化活性物質會加速疲勞的產生，減弱機體的運動能力[5]。因此，增強機體抗氧化能力可緩解疲勞的產生，并保護機體免受氧化活性物質的傷害。

玉米肽是玉米蛋白經蛋白酶水解或微生物發酵后獲得的低分子量產物。玉米蛋白富含疏水性氨基酸，使玉米肽具有很強的抗氧化活性，通過清除自由基消除疲勞[6,7]。玉米糖肽是在轉谷氨酰胺酶催化下，氨基糖與玉米肽共價結合的產物。由于氨基糖的共價結合使玉米肽的功能性質得到顯著提高，如抗氧化活性等[8]。因此，推測玉米糖肽也具有較強的抗疲勞功能。但是，目前鮮有研究關注玉米糖肽的抗疲勞活性。本實驗以D-氨基半乳糖糖基化修飾的玉米肽原料，利用ICR小鼠疲勞模型，通過負重游泳實驗、轉棒實驗及與疲勞相關生化指標的檢測，研究玉米糖肽的抗疲勞效應，為玉米糖肽在食品工業中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

D-氨基半乳糖：色譜級；堿性蛋白酶Alcalase、轉谷氨酰胺酶(1 000 u/g)：食品級；乳酸脫氫酶試劑盒、乳酸試劑盒、肝/肌糖原試劑盒、尿素氮試劑盒、總超氧化物歧化酶試劑盒、還原型谷胱甘肽試劑盒和丙二醛試劑盒；其他試劑均為分析純。ICR小鼠、標準顆粒鼠糧。

1.1.2 主要儀器設備

DF-I集熱式磁力加熱攪拌器，DU800紫外可見分光光度計，ZB-200疲勞轉棒儀，TSE991超低溫冰箱，TDL-5-A離心機，ZH游泳箱。

1.2 方法

1.2.1 玉米肽的制備

稱取40 g玉米醇溶蛋白，配成底物濃度5%的懸浮液，將燒杯放入60 ℃水浴進行磁力攪拌，調節pH至8.5后加入1.2 g堿性蛋白酶Alcalase，開始酶解反應，酶解過程中通過不斷滴加1 mol/L NaOH使pH維持在8.5，酶解2.0 h后取出立即放入沸水浴中滅酶15 min，冷卻至室溫后獲得玉米肽。

1.2.2 玉米糖肽的制備

向制備的玉米肽中添加D-氨基半乳糖12.61 g，保證反應體系中蛋白質酰基供體與D-氨基半乳糖酰基受體摩爾比為1∶1。調節pH至8.0后加入2.4 g轉谷氨酰胺酶，封膜放入44 ℃恒溫水浴振蕩器中，開始糖基化反應。7 h后，反應液冷卻至室溫，4 000 r/min離心15 min，取上清液過截斷分子量300 u的納濾膜，除去反應體系中未反應的D-氨基半乳糖和多余的鹽分，將濃縮液放入超低溫冰箱中凍結，冷凍干燥48 h后獲得玉米糖肽。

1.2.3 ICR小鼠的飼養

選用4～6周齡、18～22 g的雄性ICR小鼠，飼養于陰涼通風、相對濕度50%～60%、室溫(25±2) ℃的實驗動物清潔室，每天保證12 h光照和12 h黑暗，飼養期間小鼠自由進食和飲水。實驗過程符合動物實驗倫理要求，并盡可能將實驗動物的痛苦降至最低。

1.2.4 實驗分組與玉米糖肽使用劑量

雄性ICR小鼠108只，馴化1周后，進行游泳篩選實驗，將放入水中嗆水沉底的不會游泳或游泳姿勢不協調的小鼠剔除。將符合條件的小鼠隨機分為6組，每組18只，分別為正常組、模型組、玉米糖肽低劑量組(125 mg/kg bw，簡稱糖肽-125)、中劑量組(250 mg/kg bw，簡稱糖肽-250)、高劑量組(500 mg/kg bw，簡稱糖肽-500)和陽性對照組(玉米肽，500 mg/kg bw，簡稱玉米肽-500)。玉米肽和三個玉米糖肽劑量組在灌胃前，先將玉米肽配成濃度為500 mg/10 mL的溶液，玉米糖肽配成濃度分別為125、250、500 mg/10 mL的溶液，按每10 g 體重給藥0.1 mL進行灌胃。每天稱重后按體重調整玉米肽和玉米糖肽溶液的灌胃體積以保證相應的灌胃劑量。正常組和模型組給予生理鹽水，灌胃周期為28 d。

1.2.5 抗疲勞指標的檢測

1.2.5.1 轉棒實驗

末次給予玉米糖肽和玉米肽30 min后，依次將各組小鼠放在轉棒上，調節轉棒的速度為25 r/min，記錄各組小鼠由于肌肉疲勞從轉棒上跌下的時間，前3次為預實驗，從第4次開始計時，小鼠從轉棒上跌落的時間記為小鼠轉棒時間。如果小鼠30 min未從轉棒上跌落，則其轉棒時間記為30 min。

1.2.5.2 負重游泳實驗

末次給予玉米糖肽和玉米肽30 min后，給小鼠負體重10%的鉛塊，將小鼠放于水深不少于25 cm、水溫25 ℃的游泳箱中，記錄自游泳開始至頭部全部沉入水中8 s不能浮出水面的時間，作為小鼠的負重游泳時間。

1.2.5.3 疲勞相關生化指標的測定

末次給予玉米糖肽和玉米肽30 min后，將小鼠放于水溫25 ℃的游泳箱中游泳30 min，休息60 min后取血和肝臟。血液分離出血清，肝臟用冰預冷的生理鹽水制成10%肝勻漿液，3 000 r/min 離心10 min，取上清液用于生化指標的測定。

1.2.6 數據處理

所有數據均以平均值±標準差表示，用SPSS Statistics 19.0進行統計學分析。采用Duncan檢驗進行差異顯著性分析，P<0.05為差異顯著性水平。

2 結果與討論

2.1 玉米糖肽對小鼠體重的影響

連續灌胃28 d，玉米糖肽對小鼠體重的影響如圖1所示。

圖1 玉米糖肽對小鼠體重的影響

在實驗期間內，所有處理組的小鼠均穩定生長，玉米肽-500、糖肽-125、糖肽-250和糖肽-500組的體重增加量分別為(6.53±1.52)、(6.95±1.00)、(6.26±1.14)、(6.14±1.01)g，與正常組(7.59±0.93)g相比差異不顯著(P>0.05)。由于體重被認為是健康的指標[9]，處理組和正常組的體重增長趨勢相似，表明在實驗濃度下，玉米肽和玉米糖肽安全無毒，對小鼠的健康沒有產生不利影響。

2.2 玉米糖肽對小鼠轉棒和負重游泳時間的影響

運動耐力的下降是疲勞最直接的表現，轉棒時間和力竭游泳時間是反映運動耐力的重要指標[10]，在運動營養研究領域中常被用于評價抗疲勞的效果。測定小鼠轉棒時間和負重游泳時間以表征玉米糖肽對小鼠運動耐力的影響，實驗結果如表1所示。

表1 玉米糖肽對小鼠轉棒和負重游泳時間的影響

與正常組相比，玉米肽組和三個玉米糖肽劑量組小鼠的轉棒時間均增加，尤其是玉米糖肽中、高劑量組，小鼠的轉棒時間顯著增加(P<0.05)，分別是正常組的2.96倍和3.80倍；與正常組相比，玉米糖肽低、中、高劑量組小鼠的負重游泳時間均增加，尤其是糖肽-500組，小鼠的負重游泳時間是正常組的1.76倍，說明玉米糖肽的攝入增加了小鼠的運動耐力，原因可能是玉米糖肽易于吸收利用，可以直接向肌肉供能，提高了小鼠體內的有氧代謝能力，減輕了由運動產生的生理變化，達到了抗疲勞作用；而玉米糖肽的效果優于玉米肽，可能是因為除寡肽以外，糖基化修飾產物中共價結合的糖基也可以為機體提供能量，進而提高了小鼠的運動耐力。

2.3 玉米糖肽對疲勞相關生化指標的影響

2.3.1 玉米糖肽對小鼠血清尿素氮含量的影響

血清尿素氮是蛋白質和氨基酸的代謝產物[11]。當身體能量供應不足時，由于運動疲勞，蛋白質將被消耗，血清尿素氮水平將增加[12]。 因此，血清尿素氮含量與運動耐量之間存在負相關。玉米糖肽對小鼠血清尿素氮含量的影響如圖2所示。與正常組相比，模型組的血清尿素氮含量極顯著增加(P<0.01)，增加了33.77%，提示在持續游泳30 min后，小鼠體內糖與脂肪供能不足，蛋白質參與提供能量，出現運動疲勞。與模型組相比，玉米糖肽低、中、高劑量組小鼠的血清尿素氮含量分別降低6.73%、14.36%、15.94%，且高劑量組的血清尿素氮含量相對于玉米肽-500下降了7.03%，這說明在劇烈運動過程中，玉米糖肽可以顯著降低小鼠肌肉蛋白質的分解代謝，原因可能是玉米糖肽中含有大量的功能性短肽的同時還含有糖基，肽和糖基均可以參與糖代謝的調節，減少了肌肉蛋白質的消耗，進而減少血清尿素氮的產生。

注：##為與正常組相比差異極顯著性(P<0.01)；*為與模型組相比差異顯著性(P<0.05)；**為與模型組相比差異極顯著性(P<0.01)，下同。圖2 玉米糖肽對血清尿素氮含量的影響

2.3.2 玉米糖肽對小鼠血清乳酸含量的影響

血乳酸是在無氧條件下碳水化合物的糖酵解產物，而糖酵解是短時間內進行劇烈運動的主要能源。因此，血乳酸含量是判斷疲勞程度的重要指標之一[13]。玉米糖肽對小鼠血清中乳酸含量的影響如圖3所示。與正常組相比，模型組的血清乳酸含量極顯著增加(P<0.01)，增加了45.64%，說明劇烈運動使葡萄糖經無氧酵解產生乳酸，這部分乳酸不能在短時間內進一步分解成水和二氧化碳，導致大量的乳酸堆積，使小鼠出現運動疲勞狀態。與模型組相比，玉米糖肽低、中、高劑量組小鼠的血清乳酸含量均極顯著降低(P<0.01)，尤其是玉米糖肽中、高劑量組，血清乳酸含量恢復到正常水平。與模型組相比，玉米糖肽低、中、高劑量組的血清乳酸含量分別下降21.79%、23.57%、25.35%，且糖肽-500組的乳酸含量相對于玉米肽-500組降低了14.57%，說明玉米糖肽通過提高小鼠體內的有氧代謝能力而減少乳酸的形成，增加了運動負荷的適應能力，達到有效緩解疲勞的目的。

注：^為與正常組相比差異不顯著(P>0.05)，下同。圖3 玉米糖肽對血清乳酸含量的影響

2.3.3 玉米糖肽對血清乳酸脫氫酶活力的影響

乳酸脫氫酶被稱為肌肉活動的準確指標，血清中水平升高表明已經發生肌肉損傷[14]。玉米糖肽對小鼠血清中乳酸脫氫酶活力的影響如圖4所示。

注：#為與正常組相比差異顯著(P<0.05)，下同。圖4 玉米糖肽對血清乳酸脫氫酶活力的影響

與正常組相比，模型組小鼠血清乳酸脫氫酶活力顯著升高(P<0.05)，說明劇烈運動后小鼠肌細胞膜的通透性增加，肌肉酶溢出，導致乳酸脫氫酶在血清中的濃度升高。與模型組相比，糖肽-500組使乳酸脫氫酶活力顯著降低(P<0.05)，降低了21.39%，分析可能與玉米糖肽富含支鏈氨基酸有關。人體體外實驗已經證實，運動后補充支鏈氨基酸(BCAA，包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、苯丙氨酸等必需氨基酸可以緩解運動導致的骨骼肌蛋白質水解，促進肌肉蛋白質的合成代謝，進而積極有效地修復了骨骼肌的損傷[15,16]。玉米糖肽和玉米肽的氨基酸組成相似，且含有更多的支鏈氨基酸[8]。因此，糖肽-500修復骨骼肌損傷的能力優于玉米肽-500。

2.3.4 玉米糖肽對小鼠肌糖原和肝糖原含量的影響

能量消耗和缺乏會導致運動過程中的身體疲勞，如果能量耗盡，人體的耐力就會明顯下降。運動所需的能量最初源自糖原分解，劇烈運動后，血糖含量下降，肌糖原首先會被消耗，此后機體會分解肝糖原為代謝提供能量。玉米糖肽對小鼠肌糖原及肝糖原含量的影響如圖5所示。

由圖5a可見，與正常組相比，模型組的肌糖原含量極顯著降低，降低了31.31%，說明劇烈運動中大量的血糖被消耗時，肌糖原被分解供能。與模型組相比，實驗劑量的玉米肽不能抑制肌糖原的減少，而隨著玉米糖肽劑量的增加，肌糖原含量逐漸增加至正常水平，玉米糖肽低、中、高劑量組的肌糖原含量分別增加10.29%、39.71%和44.12%，說明玉米糖肽可以在運動過程中提供能量，以防止在運動過程中能量的消耗，這與Nikawa等[17]的研究結論相一致。

從圖5b可知，與正常組相比，模型組的肝糖原含量極顯著降低，降低了81.56%，說明劇烈運動中肌糖原消耗的同時肝糖原也會被分解為葡萄糖來維持機體血糖水平，以滿足運動需求。與模型組相比，玉米肽組和中、高劑量玉米糖肽組的肝糖原含量均極顯著增加(P<0.01)，并且與正常組相比差異不顯著(P>0.05)。糖原是機體運動的主要貯能物質，糖原的過量消耗是機體運動能力減弱的主要原因，攝入玉米肽和玉米糖肽后肝糖原含量增加，可能是玉米糖肽通過提升肝、肌糖原儲備或通過減少運動過程中糖原的消耗或兩者同時存在，延遲了小鼠肝臟和肌肉糖原的消耗，進而延緩疲勞產生，提高了小鼠的運動耐力。You等[2]發現泥鰍蛋白水解物通過延遲肝臟糖原的消耗而具有抗疲勞的作用。

圖5 玉米糖肽對小鼠肌糖原和肝糖原含量的影響

2.3.5 玉米糖肽對小鼠肝臟氧化應激狀態的影響

大量的人體和動物實驗證明，力竭性運動可使機體內產生大量自由基，脂質過氧化程度增強，導致運動性疲勞的產生甚至誘發疾病[19,29]。檢測玉米糖肽對小鼠肝臟超氧化物歧化酶活力、谷胱甘肽和丙二醛含量的影響，以表征玉米糖肽對疲勞導致的肝臟氧化應激狀態的影響，實驗結果如表2所示。

表2 玉米糖肽對小鼠肝臟超氧化物歧化酶活力以及谷胱甘肽和丙二醛含量的影響

與正常組相比，模型組的超氧化物歧化酶活力極顯著降低(P<0.01)，降低了43.22%，說明經過劇烈運動后，小鼠體內自由基的產生速率大于清除速率，超氧陰離子自由基對機體組織細胞產生損害，運動能力受到影響。與模型組相比，玉米肽組和三個玉米糖肽組的超氧化物歧化酶活力均極顯著增加至正常水平，其中，玉米肽-500組的超氧化物歧化酶活力增加72.01%，玉米糖肽低、中、高劑量組的超氧化物歧化酶活力分別增加了46.11%、62.35%、76.51%。玉米糖肽的攝入比玉米肽更能緩解運動疲勞給機體帶來的氧化性損傷，可能是因為糖基化修飾使玉米肽具有更強的抗氧化能力[8]，加速體內超氧陰離子自由基的清除，拮抗了骨骼肌在強烈收縮過程當中不斷生成的活性氧簇對超氧化物歧化酶的損耗，提升了小鼠的運動表現。這與王耀東等研究結果相一致[18]。

與正常組相比，模型組的谷胱甘肽含量極顯著降低(P<0.01)，降低了2.98倍，說明小鼠過度運動后產生了大量的氧自由基，導致機體內產生氧化應激。與模型組相比，玉米肽-500組的谷胱甘肽含量降低5.75%，而隨著玉米糖肽濃度的增加，尤其是糖肽-500組，谷胱甘肽含量顯著增加(P<0.05)，說明攝入高劑量玉米糖肽具有顯著的抗氧化效果，可以從清除過氧化氫的角度緩解疲勞的產生。

與正常組相比，模型組丙二醛含量增加42.56%，說明小鼠過量運動后，產生了大量的自由基，導致脂質過氧化作用增強，生物膜的正常結構與機能遭到破壞，釋放出丙二醛。與模型組相比，玉米肽組的丙二醛含量降低了23.54%，而低、中、高劑量玉米糖肽組的丙二醛含量分別降低19.17%、20.39%、26.21%。可能是因為玉米糖肽具有良好的抗氧化活性，能夠清除或阻斷自由基的鏈式反應，減少丙二醛的產生，從而對抗運動對心臟和骨骼肌造成的脂質過氧化損傷，起到抗疲勞的作用。

3 結論

研究D-氨基半乳糖酶法糖基化修飾玉米肽的抗疲勞效應，發現劑量為500 mg/kg bw的玉米糖肽能夠顯著延長實驗小鼠的力竭游泳時間和轉棒時間，減少實驗小鼠激烈運動時肝糖原和肌糖原的消耗以及乳酸的產生與沉積，改善實驗小鼠體內蛋白質的分解代謝及有效清除血清尿素氮，提高實驗小鼠肝臟中SOD活力及GSH含量，增強機體清除自由基的能力，改善小鼠的運動耐力，確保小鼠在激烈運動狀態下機體處于有氧運動模式，從而降低激烈運動后機體的疲勞程度，具有顯著的抗疲勞效果。