UPLC法測(cè)定豆?jié){中嘌呤含量及GCB對(duì)嘌呤吸附的研究

毛玉濤 樊 平 黃 洋 余鳳江 石應(yīng)豪

(貴陽(yáng)市糧油質(zhì)量檢測(cè)中心，貴陽(yáng) 550002)

豆?jié){作為一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白飲品，被認(rèn)為是一種合適和經(jīng)濟(jì)的牛奶替代品，也是乳糖不耐受者的理想營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充品[1]，其含量豐富的植物蛋白、磷脂、維生素及礦物質(zhì)等，以其濃郁獨(dú)特的豆香口感備受人們親睞，長(zhǎng)期飲用還可達(dá)到預(yù)防疾病的效果[2-5]。但因豆類中嘌呤含量較高，若不限量攝入易促使痛風(fēng)病人引發(fā)痛風(fēng)[6，7]。嘌呤是核酸的重要組成部分，是生物體內(nèi)新陳代謝過(guò)程中的重要物質(zhì)[8]。核酸類物質(zhì)中核糖與嘌呤之間的糖苷鍵斷裂，從而產(chǎn)生游離嘌呤堿和無(wú)嘌呤位點(diǎn)的過(guò)程稱為脫嘌呤現(xiàn)象[9]。通過(guò)一些物理、化學(xué)及生物方法[10]對(duì)食品中嘌呤物質(zhì)進(jìn)行脫除成為近年來(lái)食品生物技術(shù)的熱點(diǎn)。

GCB，即石墨化碳黑，作為一種新型吸附劑，其表面光滑無(wú)孔的石墨晶型結(jié)構(gòu)決定其對(duì)非極性化合物、弱極性化合物和部分極性化合物都具有一定的吸附作用，且通過(guò)過(guò)濾或離心等物理方法即可實(shí)現(xiàn)吸附劑與吸附基質(zhì)的有效分離，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于化合物的分離和色素去除。邵華等[11]在固相萃取柱法和基質(zhì)固相分散法的樣品前處理中運(yùn)用到GCB；宋巍等[12]在測(cè)定藥用明膠空心膠囊中的六價(jià)鉻時(shí)，利用GCB脫除提取液中的著色劑；同時(shí)，GCB應(yīng)用范圍還涉及農(nóng)藥殘留檢測(cè)[13]和獸藥殘留檢測(cè)[14]等領(lǐng)域。

本團(tuán)隊(duì)在前期研究的基礎(chǔ)上，利用超高效液相色譜(UPLC)法建立豆?jié){中腺嘌呤、鳥嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤四種嘌呤的多組分分析檢測(cè)方法，應(yīng)用新型吸附劑GCB作為食品加工助劑[15]對(duì)豆?jié){中的嘌呤物質(zhì)進(jìn)行吸附處理，通過(guò)物理方法去除吸附劑GCB，在保持了豆?jié){原有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及口感風(fēng)味的同時(shí)獲得了較高的嘌呤脫除率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

東北大豆；腺嘌呤、鳥嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品(粉末)；氫氧化鈉、氫氧化鉀、磷酸、磷酸二氫鉀、三氟乙酸、甲酸；純凈水(超純過(guò)濾)；甲醇、異丙醇-水混合清洗液；及各種檢測(cè)試劑均為色譜純；GCB(石墨化碳)為分析純。

超高效液相色譜儀(Nexera LC-40)，超聲波清洗器(JP-020S)，酸度計(jì)(ST3100)，高速冷凍離心機(jī)(TGL-20M)，磁力攪拌器(RET CVW S025)，集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(DF-101S)，超純水系統(tǒng)(Milli-Q Direct8)，立體超低溫冰箱(U410)，豆?jié){機(jī)(Power30)。

1.2 UPLC檢測(cè)條件

本實(shí)驗(yàn)利用超高效液相色譜法對(duì)豆?jié){中嘌呤的含量進(jìn)行測(cè)定。色譜分離條件為: Shim-pack C18反相柱(2.1 mm×100 mm，1.9 μm)色譜柱，以0.02 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(pH 2.95)作為流動(dòng)相，流速0.5 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量3 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)(λ1)為254 nm[16]。

利用最優(yōu)色譜條件分別進(jìn)樣檢測(cè)濃度為0.5、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0 mg/mL的四種嘌呤標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混合溶液，以嘌呤濃度梯度為橫坐標(biāo)、以峰面積為縱坐標(biāo)繪制四種嘌呤物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定線性范圍。

1.3 豆?jié){中嘌呤物質(zhì)的水解和測(cè)定

根據(jù)本課題組前期研究結(jié)果[16]，確定本實(shí)驗(yàn)豆?jié){嘌呤物質(zhì)的水解條件為：取10 mL樣品于50 mL燒瓶中，加入10 mL三氟乙酸與甲酸(1∶1)的混合液，在98～101 ℃油浴鍋中密封水解1 h，迅速冰浴冷卻，用12.5 mol/L KOH溶液中和，再用50%的H3PO4調(diào)pH至2.95，定容50 mL，離心，0.22 μm濾膜過(guò)濾，在254 nm波長(zhǎng)處測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出嘌呤的含量。

考察浸泡大豆(12 h)與干大豆[17]；去渣豆?jié){與原磨豆?jié){；調(diào)pH與離心先后順序?qū)υ節(jié){中嘌呤水解及嘌呤本底值測(cè)定結(jié)果的影響。

1.4 嘌呤吸附率的計(jì)算

研究表明，大豆中嘌呤總含量>200 mg/100 g，屬于高嘌呤食品[18,19]，嘌呤含量高于其他豆類[20]。大豆中嘌呤物質(zhì)主要為腺嘌呤和鳥嘌呤，次黃嘌呤和黃嘌呤含量較少[21]，僅占到嘌呤總含量的2%，因此本實(shí)驗(yàn)研究豆?jié){嘌呤吸附率以大豆中腺嘌呤和鳥嘌呤含量之和計(jì)算。

豆?jié){中嘌呤物質(zhì)的去除率可用公式進(jìn)行計(jì)算：

式中：C0為處理前豆?jié){中嘌呤的含量/mg/100 g；C為處理后豆?jié){中嘌呤的含量/mg/100 g。

1.5 GCB對(duì)嘌呤標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的吸附方法

配置同濃度10 mg/L的四種嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，加入一定量的GCB，超聲10 min，調(diào)pH值至2.95，0.22 um濾膜過(guò)濾，上機(jī)檢測(cè)，考察GCB的添加量對(duì)嘌呤的吸附率。

1.6 豆?jié){中嘌呤物質(zhì)脫除工藝

黃豆→去雜浸泡→磨漿過(guò)濾→超聲→加GCB→振蕩吸附→離心(10 min)→成品

取東北優(yōu)質(zhì)大豆，清水浸泡12 h，以1∶10大豆與水的質(zhì)量體積比用豆?jié){機(jī)打磨過(guò)濾得到熟豆?jié){，取50 mL豆?jié){于錐形瓶中，超聲處理一定時(shí)間，加入一定量的GCB，在一定溫度和頻率下振蕩吸附一定時(shí)間，離心得到低嘌呤豆?jié){。

探究嘌呤的吸附工藝：分別考察吸附劑對(duì)經(jīng)超聲處理與不超聲處理的豆?jié){；同等時(shí)間下靜置、振蕩與磁力攪拌的吸附環(huán)境；脫除GCB的離心轉(zhuǎn)速對(duì)豆?jié){嘌呤吸附率的影響。

1.7 GCB對(duì)嘌呤物質(zhì)吸附特性的探究

考察GCB添加量、吸附振蕩時(shí)間、吸附振蕩頻率這3個(gè)因素對(duì)豆?jié){中嘌呤物質(zhì)吸附效果的影響。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法

所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)3次重復(fù)，取平均值，利用Origin分析系統(tǒng)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 UPLC法對(duì)嘌呤的檢測(cè)分析

2.1.1 4種嘌呤物質(zhì)的分離效果

對(duì)嘌呤混合溶液進(jìn)樣分析測(cè)定。由圖1可見，與普通的HPLC嘌呤分析方法相比，本實(shí)驗(yàn)利用的UPLC分析方法具有分離效能高，分析速度快等特點(diǎn)。4種嘌呤物質(zhì)在10 min內(nèi)全部出峰，峰形、出峰時(shí)間及分離度均比較穩(wěn)定，出峰順序依次為：鳥嘌呤、腺嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤。

圖1 4種嘌呤物質(zhì)分離色譜圖

2.1.2 4種嘌呤物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

由表1可得，本實(shí)驗(yàn)用UPLC法建立了鳥嘌呤、腺嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤峰面積與相應(yīng)濃度的線性回歸方程，在0.5～40 mg/L的濃度范圍內(nèi)，4種嘌呤的線性相關(guān)系數(shù)均高達(dá)0.999 99。

表1 4種嘌呤的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 不同因素對(duì)原豆?jié){中嘌呤物質(zhì)測(cè)定的影響

食品中的嘌呤物質(zhì)一般以核酸堿基的形式存在，尤其是一些高嘌呤含量食品，因此需先通過(guò)酸水解、超聲波萃取或超臨界萃取等提取分離技術(shù)將其從食品或生物制品中提取出來(lái)再進(jìn)行分析測(cè)定，通過(guò)前期研究，用酸水解的方式將嘌呤物質(zhì)從豆?jié){中水解出來(lái)再進(jìn)行分析測(cè)定。同時(shí)，為準(zhǔn)確測(cè)得原豆?jié){中嘌呤物質(zhì)的含量，排除前處理過(guò)程中幾個(gè)關(guān)鍵因素對(duì)GCB嘌呤吸附率高低的影響，獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)論對(duì)低嘌呤豆?jié){的研究有重要意義。

2.2.1 干豆和浸泡大豆對(duì)原豆?jié){中嘌呤結(jié)果測(cè)定的影響

同等實(shí)驗(yàn)條件下，大豆浸泡12 h與干大豆直接打磨制得的2種豆?jié){，進(jìn)行水解，上機(jī)后檢測(cè)得到：經(jīng)浸泡后大豆制備的豆?jié){嘌呤本底值結(jié)果略高于干豆制備的豆?jié){，且經(jīng)浸泡后的大豆打磨的豆?jié){口感更加細(xì)膩醇厚，因此，確定大豆清洗除雜后浸泡制備豆?jié){進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

2.2.2 豆渣過(guò)濾對(duì)原豆?jié){中嘌呤結(jié)果測(cè)定的影響

同等實(shí)驗(yàn)條件下，原磨和去渣熟豆?jié){，用本實(shí)驗(yàn)的水解及測(cè)定方法處理后，做6次精密度實(shí)驗(yàn)測(cè)得豆?jié){中嘌呤物質(zhì)含量本底值分別為156.25、147.48 mg/100 g，經(jīng)過(guò)濾豆渣后的原豆?jié){其嘌呤測(cè)定結(jié)果略低于含渣豆?jié){，這是由于豆渣中也含有部分嘌呤物質(zhì)，經(jīng)過(guò)濾處理后有損失。由此可見豆渣是否過(guò)濾對(duì)原豆?jié){中嘌呤物質(zhì)的水解及測(cè)定結(jié)果有一定影響，但結(jié)果相差不大，由此而制備的低嘌呤豆?jié){亦可有原磨及去渣兩種，供痛風(fēng)病人選擇飲用。

2.2.3 pH值調(diào)節(jié)方式對(duì)原豆?jié){中嘌呤結(jié)果測(cè)定的影響

經(jīng)酸水解后的豆?jié){需將其pH值調(diào)至2.95(UPLC流動(dòng)相的pH值)，經(jīng)離心再通過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè)[16]。在具體實(shí)驗(yàn)操作中，由于10 mL豆?jié){與10 mL酸水解溶液經(jīng)油浴水解冰浴冷卻后，酸性極強(qiáng)，用12.5 mol/L的氫氧化鉀溶液調(diào)pH時(shí)，強(qiáng)烈的酸堿中和反應(yīng)產(chǎn)生巨大的熱量，促使萃取溶液產(chǎn)生大量絮狀物沉淀，且揮發(fā)出刺激性氣體，既傷害實(shí)驗(yàn)人員身體，又對(duì)嘌呤的水解產(chǎn)生影響，還由于大量鹽的加入，使得高效液相色譜柱及流路堵塞發(fā)生鹽析。

對(duì)此，本實(shí)驗(yàn)嘗試了冰浴后的萃取液先離心過(guò)濾，取少量上清液2.5 mL后調(diào)pH值以改善上述不良影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，改進(jìn)后的方法對(duì)原豆?jié){嘌呤含量的測(cè)定無(wú)影響，值得在植物性高嘌呤食品的測(cè)定中推廣。

2.3 嘌呤物質(zhì)含量的測(cè)定結(jié)果

經(jīng)測(cè)定，本實(shí)驗(yàn)用東北優(yōu)質(zhì)大豆，以10∶1(g∶mL)料液比研磨后的熟豆?jié){，嘌呤物質(zhì)含量以大豆計(jì)分別為：鳥嘌呤98.78 mg/100 g、腺嘌呤52.00 mg/100 g、黃嘌呤4.19 mg/100 g、次黃嘌呤1.28 mg/100 g，嘌呤總含量為156.25 mg/100 g。

2.4 不同濃度GCB對(duì)不同嘌呤標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的吸附效果

向已知濃度10 mg/L的4種嘌呤標(biāo)準(zhǔn)混合溶液中分別加入0.005、0.01、0.02、0.03、0.04 ug/mL的GCB，不同溶度的GCB對(duì)4種嘌呤物質(zhì)的吸附效果如圖2所示。

圖2 不同濃度的GCB對(duì)4種嘌呤物質(zhì)的吸附效果

由此可見GCB對(duì)4種嘌呤均具有較高的吸附率，在添加量為0.04 μg/mL時(shí)，GCB對(duì)鳥嘌呤和黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品的吸附率達(dá)到了90%以上。根據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，4種嘌呤物質(zhì)的吸附率與GCB的添加量呈良好的線性關(guān)系，在P<0.05情況下，不同濃度的GCB對(duì)四種嘌呤物質(zhì)吸附結(jié)果具有顯著性差異。GCB(120/400 目)比表面積100 m2/g-1，因其非多孔性，對(duì)樣品的吸附不要求其擴(kuò)散至有孔區(qū)域，所以萃取過(guò)程非常迅速。這是由于GCB碳表面的正六元環(huán)結(jié)構(gòu)，使其對(duì)平面分子有極強(qiáng)的親和力。而嘌呤是一種含C、N的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，分子式為C5H4N4，能夠與GCB的正六元環(huán)結(jié)合成為較穩(wěn)定的平面網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，因此可達(dá)到較高的吸附率。

2.5 不同吸附工藝的對(duì)比與討論

2.5.1 豆?jié){超聲處理對(duì)嘌呤吸附率的影響

從測(cè)定結(jié)果來(lái)分析，將同濃度的GCB加入未經(jīng)超聲處理的豆?jié){和經(jīng)超聲10 min處理后的豆?jié){中，經(jīng)超聲后嘌呤物質(zhì)的吸附率高于未經(jīng)超聲的豆?jié){。這是因?yàn)槌暡ㄔ谌軇┖蜆悠分g產(chǎn)生聲波空化作用，導(dǎo)致溶液內(nèi)氣泡的形成、增長(zhǎng)和爆破壓縮，從而使固體樣品分散，增大樣品與萃取溶劑之間的接觸面積，提高目標(biāo)物從固相轉(zhuǎn)移到液相的傳質(zhì)速率[18]。

圖3 豆?jié){超聲處理對(duì)嘌呤物質(zhì)吸附效果的影響結(jié)果

2.5.2 吸附環(huán)境對(duì)嘌呤吸附率的影響

實(shí)驗(yàn)對(duì)比了同等條件下，不同吸附環(huán)境對(duì)嘌呤物質(zhì)的吸附效果的影響。結(jié)果表明，3種條件吸附率從高到底依次為：振蕩(250 r/min)>磁力攪拌(1 000 r/min)>靜置。振蕩與磁力攪拌差別不大，且從吸附結(jié)束后分離GCB的難易度程度來(lái)看，磁力攪拌處理使得GCB與豆?jié){中的蛋白質(zhì)、脂肪等大分子物質(zhì)形成緊密粘合，導(dǎo)致離心和過(guò)濾均不能完全將GCB除去，因此，確定GCB的吸附環(huán)境為常溫下振蕩吸附。

2.5.3 脫除GCB的離心轉(zhuǎn)速對(duì)嘌呤吸附率的影響

經(jīng)GCB吸附處理后的豆?jié){，需經(jīng)過(guò)離心脫除GCB，再經(jīng)酸水解后上機(jī)測(cè)定嘌呤含量。本實(shí)驗(yàn)控制離心時(shí)間為10 min，探索不同轉(zhuǎn)速對(duì)吸附劑GCB的脫除效果及嘌呤吸附率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)速在達(dá)到8 000 r/min及以上時(shí)，豆?jié){中GCB脫除較徹底，肉眼觀察豆?jié){呈現(xiàn)正常的乳白色，無(wú)GCB殘留。隨著轉(zhuǎn)速的增加，GCB脫除越徹底，同時(shí)豆?jié){中嘌呤含量越低。但是考慮到工業(yè)化生產(chǎn)的實(shí)際情況，建議中試選擇12 000 r/min(10 min)的離心條件。

2.6 不同因素對(duì)GCB脫除豆?jié){中嘌呤物質(zhì)吸附率的影響

2.6.1 GCB添加量對(duì)豆?jié){嘌呤吸附率的影響

從圖4可以看出，隨著GCB添加量的不斷增大，豆?jié){中嘌呤物質(zhì)的吸附率逐漸增大。根據(jù)食品工業(yè)用加工助劑使用原則“使用時(shí)應(yīng)具有工藝必要性，在達(dá)到預(yù)期目的的前提下應(yīng)盡可能降低使用量”[12]，同時(shí)從節(jié)約成本方面考慮，可以選擇GCB在0.01g/mL濃度下進(jìn)行中試。

圖4 不同因素對(duì)GCB脫除豆?jié){中嘌呤物質(zhì)吸附率的影響

2.6.2 振蕩時(shí)間對(duì)豆?jié){嘌呤吸附率的影響

由圖4可以看出，隨著振蕩反應(yīng)時(shí)間的增加，嘌呤的吸附率呈現(xiàn)先增加，再趨于平緩的趨勢(shì)。其中振蕩處理60 min，嘌呤脫除率達(dá)到最大。說(shuō)明一定濃度和條件下GCB對(duì)豆?jié){中嘌呤物質(zhì)的吸附有一個(gè)“時(shí)間閾”，超過(guò)60 min出現(xiàn)解吸現(xiàn)象，因此吸附時(shí)間1 h最佳。

2.6.3 振蕩頻率對(duì)豆?jié){嘌呤吸附率的影響

由圖4可以看出，隨著振蕩頻率的增加，嘌呤的吸附率呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì)，振蕩頻率為250 r/min時(shí)，嘌呤脫除率達(dá)到最大，再提高振蕩頻率會(huì)發(fā)生解吸現(xiàn)象，企業(yè)可根據(jù)實(shí)際條件選定該頻率進(jìn)行中試。

2.7 低嘌呤豆?jié){的品質(zhì)評(píng)價(jià)

使用GCB吸附的方法對(duì)豆?jié){中的嘌呤物質(zhì)進(jìn)行脫除，再通過(guò)離心去除吸附劑GCB，得到的豆?jié){其感官要求(外觀色澤、氣味滋味、組織狀態(tài))正常，具有豆?jié){應(yīng)有的氣味與滋味。

將原豆?jié){及經(jīng)GCB吸附處理后的低嘌呤豆?jié){進(jìn)行品質(zhì)對(duì)比，其理化指標(biāo)(固形物含量、蛋白質(zhì)含量和脂肪含量)測(cè)定結(jié)果分別見表2，經(jīng)處理后的低嘌呤豆?jié){營(yíng)養(yǎng)有一定損失，但檢測(cè)結(jié)果完全達(dá)到了QB/T 2132—2008中的要求。

表2 GCB吸附處理后的豆?jié){理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

本研究針對(duì)豆?jié){中含有的嘌呤，采用UPLC法建立了豆?jié){中腺嘌呤、鳥嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤4種嘌呤的多組分分析檢測(cè)方法，測(cè)得本實(shí)驗(yàn)用東北優(yōu)質(zhì)大豆嘌呤總含量達(dá)到了156.25 mg/100 g；選用新型吸附劑GCB作為食品加工助劑對(duì)豆?jié){中的嘌呤物質(zhì)進(jìn)行吸附處理。探索了吸附工藝和條件對(duì)豆?jié){吸附率的影響；改進(jìn)了豆?jié){嘌呤酸水解及UPLC分析測(cè)定的條件，探究了GCB的吸附性能，在保持了豆?jié){原有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及口感風(fēng)味的同時(shí)，獲得了57.23%的嘌呤脫除率，為低嘌呤豆?jié){及低嘌呤豆制品的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)參考。