巴戟天-續斷-益母草組藥干預腎虛血瘀型多囊卵巢綜合征網絡藥理學作用機制?

袁仁智，肖衛瓊，唐 鵬，康開彪，潘 文

1 甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050；2 甘肅省中醫藥研究院；3 邵陽學院

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是影響女性最常見的內分泌紊亂疾病，在育齡女性中發病率約5%～20%，且呈不斷上升趨勢［1］。PCOS 主要包括月經周期紊亂、高雄激素血癥和肥胖等臨床癥候群［1］。PCOS的發病機制及其相關癥狀雖有待解釋，但癥狀和體征的異質性提示其發病因素多樣［2］。有學者認為，PCOS 的發生不僅受遺傳影響，也與下丘腦-垂體-卵巢軸調控功能紊亂、高胰島素血癥、肥胖、精神、心理、環境等因素密切相關［3］。西醫主要通過抗雄激素、胰島素增敏劑及促排卵藥物干預，雖有一定療效，但常伴有腫脹、胃痛、盆腔或下腹部痛等不良反應，嚴重時引發卵巢過度刺激綜合征，出現頭暈、惡心、嘔吐、精神抑郁甚至導致卵巢早衰。中醫藥辨證論治的個性化方案在治療PCOS 方面有獨到之處。通過整理古今中醫名家治療PCOS 疾病或癥狀的方劑，運用中醫傳承輔助系統進行數據分析發現，中醫治療PCOS 證候中以腎虛血瘀型和肝郁腎虛型最多，腎、脾、肝臟功能失調是PCOS 主要病機，補虛和解郁是治療PCOS 的根本方法，而補腎健脾、疏肝解郁、理氣化痰、活血化瘀是治療PCOS的主要思路［4］。

中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）作為目前國內較為完善的草藥成分靶點數據庫，共收錄了505 味草藥的12 144 個活性成分、關鍵藥物動力學性質、類藥性、作用靶點、參與的通路及相關疾病，為中草藥檢索、新藥開發和中醫藥基礎理論的現代闡釋提供了新手段和新方法。

本研究提取腎虛血瘀型方劑核心組藥，采用網絡藥理學方法分析藥物的化學成分、靶點和通路之間的關系，試圖揭示中藥治療PCOS 的作用機制。

1 資料收集與分析方法選擇

借助中國中醫科學院研制的中醫傳承輔助平臺（2.5版本）建立PCOS方劑數據庫并進行數據挖掘［4］，數據庫收集了130 位現代醫家的352 個方劑，對其中的腎虛血瘀型方劑運用熵聚類法進行關聯分析。

2 方法與結果

2.1 巴戟天-續斷-益母草組藥挖掘及其活性成分篩選和靶點預測進入自建的中醫傳承輔助平臺PCOS 數據庫，通過數據分析組方規律，獲得腎虛血瘀型方劑25個，涉及藥物96味。運用關聯規則和熵聚類法發現，當支持度為6，置信度為0.6時，巴戟天-續斷-益母草配伍概率較高。因此，選取巴戟天-續斷-益母草為腎虛血瘀型PCOS 的核心組藥進行網絡藥理學分析。

進入TCMSP 平臺（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），選擇Herb name，依次輸入“Bajitian”“Xuduan”“Yimucao”，分別獲得174 個、31 個和51 個化學成分，然后根據口服生物利用度（OB）和藥物相似度（DL）進行篩選，設為OB≥30%，DL≥0.05，去重后得到巴戟天-續斷-益母草活性化合物34個（巴戟天18個，續斷6個，益母草8個，巴戟天和續斷共有2 個）。同時在TCMSP 中獲得34 個化合物的620 個潛在靶點（其中有6 個化合物無靶點），篩去重復項，整理得到140個靶點，見表1。

表1 巴戟天-續斷-益母草組藥活性化合物特征

2.2 藥物與疾病共靶點及化合物-靶點網絡NCBI是一個關于分子生物學、生物化學和遺傳學知識的存儲和分析的數據庫。進入NCBI 基因數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov），以“polycystic ovarian syndrome”為關鍵詞檢索，選擇種屬“人類”，得到228個PCOS疾病基因靶點。

將巴戟天-續斷-益母草組藥與PCOS 疾病靶點分別錄入Excel 建立文檔，通過比對找到兩者的共有靶點19 個，涉及化合物25 個，這些可能是PCOS 的主要作用靶點。將共靶點及其對應化合物數據導入Cytoscape 3.7.0 構建化合物-靶點（CT）網絡，44 個節點代表化合物和靶點，86 條連線代表化合物和靶點的關系，每個靶點涉及的化合物均值為4.52，每個化合物涉及的靶點均值為3.44，涉及4 個及以上靶點的化合物有8 個，最多的有17個靶點。涉及5個及以上化合物的靶點有5 個，最多的涉及20 個化合物。這8 個化合物和5個靶點可能與PCOS關系最為密切，見表2、圖1。

表2 巴戟天-續斷-益母草組藥與PCOS疾病共靶點

圖1 化合物-靶點網絡圖（圓形代表化合物，三角形代表靶點）

2.3 共靶點蛋白互作網絡藥物作用既可以表現為直接與靶點結合和單一的信號通路，也可以是直接靶點和間接靶點共同調控等多靶點、多通路、多層次的復雜網絡模式。因此通過蛋白之間的相互作用關系即PPI 網絡可以進一步深入分析藥物對PCOS的重要影響。進入String數據庫，點擊Multiple Proteins，輸入19 個共靶點，種屬“人類”，設置評分為0.4，網絡邊緣含義為“分子作用”，得到蛋白互作網絡，節點數為19，邊數為99，平均節點度為10.4，局部聚類系數為0.852。PPI 富集P值＜1.0e-16，這意味著蛋白質之間的相互作用較基因組中隨機的一組相似大小的蛋白質所預期的更多，即蛋白質之間的活躍度較高，見圖2。

圖2 蛋白互作網絡

2.4 靶點通路通過DAVID 數據庫得到19 個共靶點的基因功能GO 富集1 048 條，KEGG 信號通路富集21條。其中細胞組成25個，主要包括細胞外空間、細胞外區域、分泌顆粒、細胞質囊泡、細胞內囊泡等；生物功能28 個，主要包括受體結合、細胞因子活性、類固醇激素受體活性、生長因子受體結合、脂質結合、轉錄因子活性、生長因子活性、氧化還原酶活性、受體調節劑活性、調節區DNA 結合、調節區核酸結合等；生物過程995 個，主要涉及對有機物的反應、細胞增殖、對脂質的反應、對含氧化合物的反應、對外部刺激的反應、生物合成過程的正調節、細胞凋亡、程序性細胞死亡、大分子生物合成、細胞內信號轉導的正調節、對類固醇激素刺激的細胞反應、血管發育、單一生物代謝過程、趨化因子生物合成、細胞活化、血液循環、免疫效應過程和炎癥反應等；信號途徑主要有HIF-1信號通路、類風濕性關節炎、1 型糖尿病、炎癥性腸病、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用、NOD 樣受體信號通路、PI3K-Akt 信號通路、癌癥的途徑、雌激素信號通路、胰島素抵抗、卵母細胞減數分裂、Jak-STAT 信號通路、非酒精性脂肪性肝病、癌癥中的轉錄失調、同種異體移植排斥反應、膀胱癌等；設置參數為FDR＜0.05，P＜0.05，獲得GO 條目189 個，KEGG條目1條即HIF-1信號通路。21條信號通路富集結果采用OMICSHARE（http：//www.omicshare.com）在線工具作出泡泡圖。同時借助Cytoscape 3.7.0構建靶點-通路網絡，見表3—4、圖3—5。

表3 預測靶點基因功能富集

表4 潛在靶點信號通路富集

圖3 潛在靶點生物功能富集圖

圖4 預測靶點信號通路富集圖

3 討論

網絡藥理學是一門從生物網絡角度研究疾病發生和發展過程，認識藥物與機體的相互作用并指導新藥發現的學科，在研究工具上，該學科借助高通量組學數據、分子網絡數據以及計算機模擬分析，研究藥物的作用機制和促進藥物創新［5］。而中醫的整體觀念、辨證論治理論與網絡藥理學的系統動態觀高度一致，因此，運用網絡藥理學方法研究中醫復方的作用機制成為目前藥理學研究的一個熱點［6］。本研究通過數據挖掘找出了治療腎虛血瘀型PCOS 的一組核心組藥巴戟天-續斷-益母草（B-X-Y），這3 味藥是中醫臨床專家廣泛使用的補腎活血藥物。研究借助系統藥理學、藥代動力學和生物信息學方法確定組藥的活性化合物及與PCOS相關的靶點和通路。

圖5 靶點-通路網絡圖

通過TCMSP 平臺的OB 和DL 篩選，獲得巴戟天-續斷-益母草的34 個化合物和140 個靶點，發現其中靶點最多的是槲皮素（87 個靶點）和山奈酚（55 個靶點），其次是β-谷甾醇、異鼠李素、花生四烯酸和蒽醌。可見，槲皮素和山奈酚是治療PCOS 的主要化合物，這與LIU 等［7］研究二仙湯治療PCOS 的結果一致，也與本項目前期研究菟絲子治療腎虛血瘀型PCOS 的結果相吻合，不同之處在于LIU等［7］研究主要來自二仙湯當中的淫羊藿、知母和黃柏，本研究中槲皮素、山奈酚和異鼠李素（36 個靶點）、花生四烯酸（31 個靶點）均來源于益母草。槲皮素是一種植物多酚，除了在血小板聚集、脂質過氧化、毛細血管通透性、細胞攝取和自由基中的積極作用外，還具有抗炎、抗癌及抗病毒活性［8］。WANG 等［9］研究結果表明，槲皮素可抑制Toll樣受體/NF-κB信號通路，改善PCOS大鼠模型中卵巢組織的炎癥微環境。REZVAN 等［10］研究發現，在隨機安慰劑對照的雙盲試驗中，口服槲皮素補充劑可增強AMPK 水平，改善PCOS 的代謝特征。山奈酚是一種膳食類黃酮，具有抗氧化、抗炎、抗細胞凋亡、抗癌、雌激素和抗雌激素活性［11］。其通過減弱炎癥和細胞凋亡來調節MAPK 通路以防止IR 損傷［12］。異鼠李素屬于黃酮類，分子式為C16H12O7，其作用廣泛，有擴張冠脈、保護血管內皮及抗血栓、抗腫瘤細胞［13］、抗病毒［14］及減輕氧化應激、抗細胞凋亡［15］和抗炎［16］等作用。花生四烯酸是一種ω-6 多不飽和脂肪酸，為花生油中飽和的花生酸的相對物，具有酯化膽固醇、增加血管彈性、降低血液黏度，調節血細胞功能等一系列生理活性，對預防心血管疾病、糖尿病和腫瘤等具有重要作用。相關文獻［17-18］報道糖異生的增加是2 型糖尿病基礎狀態下高血糖的一個重要因素，而吳勉云等［19］實驗表明，花生四烯酸能顯著降低糖異生兩個關鍵酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和葡萄糖-6-磷酸酶的轉錄水平以及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的酶活性。來源于巴戟天的兩種蒽醌：2-羥基-1，5-二甲氧基-6-（甲氧基甲基）-9，10-蒽醌和1，6-二羥基-5-甲氧基-2-（甲氧基甲基）-9，10-蒽醌，分別有31個靶點和29個靶點，兩者的口服生物利用度較高，分別為95 和104。蒽醌類化合物是各種天然醌類化合物中數量最多的一類化合物，具有抗菌消炎［20］、抗病毒［21-23］、抗腫瘤［24-25］、利尿、活血［26］、降血脂［27］和增強免疫功能［28］等作用。β-谷甾醇的51 個靶點來源于巴戟天和續斷。β-谷甾醇是植物甾醇類成分之一，屬于四環三帖類化合物，有降膽固醇、止咳、祛痰及抑制腫瘤和修復組織作用。用于Ⅱ型高脂血癥、動脈粥樣硬化癥和慢性氣管炎，亦用于早期子宮頸癌及皮膚潰瘍等［29］。由于巴戟天-續斷-益母草組藥中已知的化合物成分多達256 種，它們中可能有多種成分通過多種機制作用于多個靶標。

藥靶網絡和PCOS網絡有19個重疊基因，富集于21 條通路。其中有5 個靶點富集的通路有HIF-1 信號通路、類風濕性關節炎、1 型糖尿病、炎癥性腸病、TNF 信號通路，涉及基因12 個，根據其所涉通路依次排序為：IL-6（15 條）、IL1β（11 條）、IFNG（11 條）、INS（6 條）、CCL2（6 條）、IL-2（5 條）、VEGFA（5 條）、NOS3（4 條）、PPARG（3 條）、MMP2（3條）、AR（1 條）、HMOX1（1 條），結合蛋白互作網絡關系（表2 和圖3），得分前10 位的基因是IL-6、INS、VEGFA、NOS3、PPARG、MMP2、CCL2、IL1β、IL2和ESR2，因此IL-6、IL-1B、IFNG、INS、CCL2、IL2、VEGFA 等，可能是PCOS治療中涉及的關鍵基因。如TNF主要由巨噬細胞分泌，并可誘導某些腫瘤細胞系的細胞死亡。CHEN 等［15］發現PCOS 患者血清TNF-α和AMH高表達，血清TNF-α和AMH水平與PCOS高度相關，可以作為預測PCOS 風險的診斷指標。FASSHAUER 等［30］發現TNF-α和胰島素能上調脂肪細胞上IL-6表達，胡靜等［31］研究發現IL-6主要與IR 有關，TNF-α 和IL-6 協同作用能加重PCOS病情的發生發展。TNF 信號通路和胰島素抵抗與PCOS發生及發展密切相關已成為共知。最近的研究發現，NOD 樣受體信號通路也對PCOS 產生影響。賀晶等［32］探討促性腺釋放激素激動劑輔助腹腔鏡下卵巢巧克力囊腫剝離術對TNF-α和IL-6 水平的影響研究表明，該術不僅能提高妊娠率，還能降低NOD1、NOD2 的表達，下調血清NF-α和IL-6 水平，抑制患者體內炎癥狀態。

總之，巴戟天-續斷-益母草組藥治療PCOS 是分子間協同作用的結果，通過干預分子網絡、生物過程和通路來恢復機體平衡，具有多成分、多靶點的特點，其對PCOS 的治療主要是通過補腎活血化瘀達到抗炎、抗腫瘤、調節血脂、促進微循環及改善胰島素抵抗的目的，與現代醫藥治療多囊卵巢綜合征的作用機制相符合。