苦瓜功能稻米的淀粉理化特性分析

陽永建 袁 潔 陶湘林 何 艷 唐漢軍

(1.湖南大學隆平分院，湖南 長沙 410125；2.湖南省農業科學院農產品加工所，湖南 長沙 410125)

隨著健康產業的發展，普通食品功能化和功能食品主食化成為一個重要趨勢[1]，作為重要主食的水稻育種戰略也隨時代的發展而變化，功能稻作為育種的一個重要方向，近年取得了豐碩的成果，如高直鏈淀粉[2]、高γ-氨基丁酸(GABA)[3]、抗高血壓[4]、抗氧化[5-6]、抗過敏[7]、巨胚[8]等水稻品種相繼問世。課題組前期采用花粉管通道法將苦瓜DNA導入秈稻，獲得農藝性穩定遺傳的子代(2017年農業部審定，品種名：早優517)，并證明苦瓜DNA片斷成功整合進子代DNA中，且生理活性的主要目標物質皂苷等成分在胚乳中顯著表達，但關于苦瓜DNA的導入對水稻品質的影響尚未明確，尤其是苦瓜DNA的導入對水稻淀粉精細結構的影響還需進一步研究。研究擬針對導入苦瓜基因的功能稻早優517(D9)，系統分析D9和受體(RT)胚乳淀粉的顆粒形態、粒徑分布、結晶結構、糊化、凝膠質構和分子組成等特性，以期為中國功能稻的加工及應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 稻谷樣品

苦瓜功能稻早優517成熟稻谷(試驗編號D9、2018年、湖南)和受體成熟稻谷(試驗編號RT、2018年、湖南)：湖南省水稻研究所何登驥研究員提供。稻谷樣品種植在4片相連的水田，總面積約0.67 hm2，其中一片種植RT，其他3片田種植D9。每片田的稻谷分別收獲，分別隨機取稻谷樣品約10 kg。曬干至適當含水量后，分別采用礱谷機去殼的糙米作為試驗材料。

1.1.2 主要試劑

鹽酸、硫酸：優級純，國藥集團化學試劑有限公司；

氫氧化鈉、乙醇、正戊醇、乙醚、二甲基亞砜(DMSO)、碘化鉀：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器

掃描電子顯微鏡(SEM)：S-4800型，日本Hitachi公司；

激光粒度分析儀：LS-POP(6)型，珠海歐美克儀器有限公司；

X射線衍射儀：D8 Advance型，德國Bruker公司；

傅里葉紅外光譜分析儀(FTIR)：Nexus 470型，美國梅特勤公司；

差示掃描量熱計(DSC)：Q2000型，美國TA公司；

快速黏度分析儀(RVA)：Super4型，澳大利亞Newport Scientific公司；

質構分析儀：CT3型，美國Brookfield公司；

礱谷機：FC2K-Y型，株式會社山本制作所。

1.2 試驗方法

1.2.1 淀粉樣品制備 稻米胚乳淀粉的樣本制備采用實驗室常用的堿—醇提取法[9]。稱取樣品200 g，在4 ℃水浸泡24 h后，經磨漿過篩(120目)，離心(5 000×g，5 min，4 ℃)收集濕淀粉。加濕淀粉體積的4倍氫氧化鈉溶液(0.1 mg/100 mL)，4 ℃下攪拌2 h以上，離心(5 000×g，5 min，4 ℃)收集濕淀粉，此處理重復3次后用0.1 mol/L的HCl溶液調節pH值至中性。濕淀粉在4倍體積去離子水中充分分散，加入正戊醇100 mL，激烈攪拌2 h以上，然后靜止12 h以上，除去醇層，重復此步驟至醇液層透明為止。過400目篩后，離心(5 000×g，5 min，4 ℃)收集濕淀粉。用G4砂芯過濾器充分抽濾，依次加適量無水乙醇3次、乙醚3次進行洗滌，充分抽干淀粉后，于40 ℃下揮發殘余乙醚。作為顆粒淀粉樣品在干燥器中保存備用。

取上述顆粒淀粉樣品約1 g，加10 mL DMSO，待充分糊化后加入95%乙醇50 mL，攪勻后離心(5 000×g，10 min)收集淀粉。此步驟重復2次。然后在G4砂芯過濾器上抽濾收集淀粉，并依次加入適量無水乙醇3次、乙醚3次進行洗滌，充分抽干后，于40 ℃下揮發殘余乙醚。作為高純度脫脂淀粉樣品在干燥器中保存備用。

1.2.2 SEM觀察 采用Bhat等[10]的方法處理樣本后，采用掃描電子顯微鏡進行觀察。

1.2.3 粒度分析 參照陶湘林等[11]的方法，采用激光粒度分析儀進行分析，每個樣品重復測定3次。

1.2.4 結晶結構分析 參照Mir等[12]的方法，采用粉末X射線衍射儀進行分析，每個樣品重復測定3次。

1.2.5 FTIR分析 根據滿建民等[13]的方法，采用傅里葉紅外光譜分析儀進行分析，每個樣品重復測定3次。

1.2.6 DSC分析 參照陶湘林等[11]的方法，采用差示掃描量熱計進行分析，每個樣品重復測定3次。

1.2.7 RVA分析 參照Zhu等[14]的方法，采用快速黏度分析儀分析，每個樣品重復測定3次。

1.2.8 膨脹勢測定 根據Tang等[9]的方法測定淀粉膨脹勢，每個樣品重復測定3次。

1.2.9 凝膠質構分析 針對上述膨脹勢測定用獲得的淀粉凝膠，采用質構分析儀進行質構分析，選用直徑2 mm圓柱形不銹鋼探頭TA10，采用TPA分析模式，探頭壓縮速度為0.5 mm/s，壓縮距離為3 mm，每個樣品重復測定10次。

1.2.10 淀粉—碘溶液可見光譜分析 根據李林靜等[15]的方法測定，并基于680 nm碘藍值計算淀粉的表觀直鏈淀粉含量，每個樣品重復測定3次。

1.3 數據統計分析

所有數據均采用Excel 2010和Origin 2018軟件進行統計分析處理。

2 結果與分析

2.1 淀粉顆粒的形態與大小

D9和RT淀粉顆粒形態與大小，在SEM的觀察中(圖1)未見明顯的差異，均是典型的水稻淀粉形態。兩者的淀粉顆粒均為表面光滑的不規則多面體，平均大小約為5 μm。通過激光粒度儀分析，淀粉顆粒的體積分布圖譜幾乎是重疊在一起(圖2)，對數據分析發現(表1)，D9和RT的平均粒徑均為5.5 μm，3～9 μm的中顆粒體積百分比分別為93.2%和92.3%，D9和RT無顯著差異。但D9和RT在3 μm以下小顆粒體積百分比分別為2.7% 和2.4%，而9 μm以上的大顆粒體積百分比分別為4.2%和5.3%，D9和RT有顯著差異。

表1 淀粉粒徑的體積百分比?Table 1 Volume percentage of starch particle size (n=3)

圖1 淀粉顆粒形態SEM觀察Figure 1 SEM observation of starch granule morphology

圖2 淀粉的粒度分布圖譜Figure 2 Particle size distribution map of starch

說明苦瓜DNA的導入可一定程度地干預秈稻淀粉顆粒形態的相關基因表達，導致淀粉顆粒的粒徑組成發生變化。

2.2 淀粉顆粒的分子有序性

淀粉顆粒的廣角X射線衍射圖譜如圖3所示，主峰的位置主要分布在13°～25°，在16°～19°有特征偶極峰，在20°左右觀察到源于直鏈淀粉—脂肪的單螺旋結構形成的小峰，D9和RT均屬典型的谷物類A型結晶淀粉[16]。淀粉的結晶區是由支鏈淀粉的雙螺旋結構規則排列形成[17]，D9淀粉的相對結晶度為37.75%，RT的相對結晶度為36.14%，統計上有顯著差異(表2)。

圖3 淀粉顆粒的廣角X射線衍射圖譜Figure 3 Wide angle X-ray diffraction patterns of starch granules

D9與RT淀粉的傅里葉變換紅外光譜如圖4所示，主要差異表現在1 050～950 cm-1波數區間，參照滿建民等[13]的方法，測量波數1 045，1 022，995 cm-1各峰頂點至基線的高度(峰強度)，計算出1 045 cm-1/1 022 cm-1和1 022 cm-1/995 cm-1的峰強度比值(表2)，D9淀粉分別為0.67和1.66，RT淀粉分別為0.60和1.18，D9與RT之間均有顯著差異，表明D9淀粉顆粒的分子有序化程度更高[13]，與相對結晶度的結果一致。

表2 淀粉顆粒的分子有序性?Table 2 The molecular ordering of starch granules (n=3)

圖4 淀粉顆粒的FTIR圖譜Figure 4 The FTIR spectra of starch granules

說明苦瓜DNA的導入不僅對秈米淀粉顆粒形態的基因表達有一定程度的干預，同時對淀粉顆粒組織結構的形成機制產生實質影響。

2.3 淀粉顆粒的糊化特性

DSC圖譜顯示(圖5)，D9和RT淀粉的結晶結構融解，分子完全變為無序狀態的溫度區間存在顯著性差異。RVA圖譜也表現了顯著不同(圖6)。DSC和RVA分析的數據列于表3。DSC分析的起糊溫度、峰溫度和終結溫度，D9分別為65.5，71.3，78.2 ℃，糊化溫度范圍12.7 ℃；RT分別為77.8，81.8，86.7 ℃，糊化溫度范圍9.8 ℃。但D9的糊化焓值為10.1 J/g，顯著高于RT的8.5 J/g。RVA分析，D9到達最高黏度的時間為4.4 min，比RT快0.6 min，獲得的糊化溫度分別為74.7，82.4 ℃，與DSC的分析結果一致。另外，D9的最高黏度、最低黏度、崩解值和終黏度分別為2 683.0，1 074.0，1 609.0，1 499.50 mPa·s，顯著高于RT的各指標值。但D9的回生值為425.5 mPa·s，顯著低于RT的463.5 mPa·s。從溫度的視角，D9淀粉較易糊化，但較難老化。從分子秩序和糊化特性的所有指標值推斷，D9淀粉的支鏈分子含量較高，分子量較大，分支較多而鏈長較短[14,17-19]，雖然形成的結晶區相對較大，但結晶結構強度較低，致使熱穩定性較差。同時可能與D9淀粉小顆粒相對較多，大顆粒相對較少也有一定關系[17,19]。

表3 淀粉顆粒的糊化特性?Table 3 The gelatinization characteristics of starch granules(n=3)

圖5 淀粉顆粒的DSC圖譜Figure 5 The DSC spectrum of starch granules

圖6 淀粉的RVA圖譜Figure 6 The RVA map of starches

從上述分子秩序和糊化特性的結果可推斷，D9稻米煮熟性較好且米飯老化較慢，作為口糧用的加工品質等得到一定程度提升。

2.4 淀粉的凝膠特性

淀粉的凝膠特性如表4所示。D9的膨脹勢為20.01 g/g，顯著高于RT的18.62 g/g。D9凝膠質構指標的硬度、黏性、彈性和咀嚼性等均高于RT，而內聚力和黏著性等均低于RT。這些結果支持D9淀粉的支鏈分子含量較高，分子量較大，分支較多而鏈長較短的推斷[19]。但除彈性指標外，D9和RT的各單項指標之間統計上無顯著性差異，可能是質構測量樣品平行數量較少，同時使用的測量探頭直徑太小，獲得的數據少而偏差值太大所致，在今后的測量中應改進。

表4 淀粉的凝膠特性?Table 4 The gel properties of starches

結果表明D9稻米因蒸煮熟化后的彈性增加，與原受體稻米比較，口感品質可能更偏向粳稻米的質感。

2.5 淀粉的分子及組成特性

淀粉分子與碘分子可形成包含復合物，使溶液呈藍色。D9和RT吸收光譜存在顯著差異(圖7)，在550～800 nm范圍內D9的吸光度均低于RT。如表5所示，最大吸收波長(λmax)，D9為561 nm，RT為581 nm。波長680 nm的藍值(BV680 nm)，D9為0.16，RT為0.20。基于BV680 nm計算的表觀直鏈淀粉質量分數，D9為13.33%，顯著低于RT的16.47%。

表5 淀粉的分子及組成特性?Table 5 The molecular and compositional properties of starches (n=3)

圖7 淀粉—碘溶液的可見光吸收圖譜Figure 7 The visible light absorption spectrum of starch iodine solution

這些結果表明，D9不僅直鏈淀粉含量較低，且支鏈分子的鏈長較短[17,19]。苦瓜DNA的導入引起了受體的淀粉生物合成機制變化，D9淀粉的品質提升主要是基于淀粉分子水平的變化。

3 結論

研究將導入苦瓜DNA水稻品種(早優517)胚乳淀粉的顆粒形態、粒徑分布、結晶結構、糊化、凝膠質構和分子組成等特性與受體進行了比較。早優517淀粉顆粒組織的分子秩序較高，表現了較大的最高黏度、最低黏度、崩解值、終黏度、膨脹勢和凝膠彈性值，而熱穩定性、凝膠回生值等指標較小。這些理化特性的差異，是源于較小的直鏈淀粉含量、最大吸收波長和碘藍值等指標。導入苦瓜DNA引起了淀粉分子組成和結構的顯著變化。推斷：早優517作為口糧用米的場合，食味品質優于受體。

遠緣植物DNA導入，可使秈稻獲得植物生理活性成分的顯著表達，同時對稻米淀粉的生物合成機制產生實質性改變，這些改變包含有利于食味品質改善的良性機制。但期望進一步打破各研究領域間的無形壁壘，健全多領域合作攻關機制，廣泛共享育種科研人員掌握的育種資源，加快淀粉分子結構與理化性質之間的數量關系，以及淀粉生物合成機制的研究進展。