mTOR磷酸化水平對成骨MC3T3E1細胞增殖、自噬和分化的作用及其機制

李希寧,翁 偉,沈哲源,豆曉杰,趙 宇,閔繼康

（1.湖州師范學院醫學院病理學教研室，浙江 湖州313000；2.湖州師范學院附屬第一醫院骨科，浙江 湖州313000）

骨質疏松癥已經成為許多國家的主要公共衛生問題，具有潛在的發生嚴重骨折的風險，并且其患病率隨著人口老齡化的增長而增加［1］。成骨細胞是負責骨形成過程的功能細胞，越來越多的研究［2-3］顯示成骨細胞功能障礙是骨質疏松的主要原因。目前預防和治療骨質疏松癥的藥物主要關注點在促進成骨細胞的增殖和分化。哺乳動物雷帕霉素靶分子（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一個高度保守的激酶，屬于磷脂酰肌醇-3激酶（phosphotylinosital-3 kinase，PI3K） 家 族 的 一員［4］。雷帕霉素（rapamycin，RAPA）是mTOR通路的抑制劑，也是自噬的激活劑，其具有細胞保護作用，與細胞的生長、增殖和分化等密切相關［5］。RAPA對mTOR的抑制作用在體外可損傷小鼠骨髓基質細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的增殖和成骨分化，并可導致小梁狀骨的丟失［6］。相反，激活mTOR信號通路可以促進BMSCs向成骨細胞方向分化［7-8］。RAPA通過藥理作用抑制mTOR信號明顯阻止Wnt7b誘導的小鼠ST 2細胞分化，而Raptor的遺傳缺失減輕了Wnt7b誘導的小鼠高骨量表型，表明Wnt7b通過激活mTOR促進骨形成［9-10］，其機制可能為mTOR通過促進谷氨酰胺分解代謝和綜合應激反應（integrated stress response，ISR）部分介導Wnt的成骨作用，進而誘導成骨細胞分化所必需的蛋白合成和相關基因的表達［11-13］。因此，mTOR似乎是多種骨合成信號下游的一個常見效應因子。雖然mTOR發揮其生物學功能的途徑尚未完全清楚，但其激活mTOR被認為是改善細胞功能和機體健康的重要機制。本研究分別采用mTOR抑制劑和激活劑改變磷酸化mTOR（p-mTOR）水平，并采用分子生物學技術探討p-mTOR水平的變化對成骨細胞增殖、自噬和分化功能的影響，為骨質疏松的防治策略提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器小鼠胚胎前體成骨MC3T 3-E1細胞（中國科學院細胞庫）。α-MEM培養基（美國Gibco公司），二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）、胰蛋白酶、0.2%茜素紅S試劑盒、CCK-8試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），表面活性劑聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100，上海源葉生物科技有限公司），青、鏈霉素雙抗混合液（南京凱基生物科技發展有限公司），胎牛血清（天津市灝洋生物制品科技有限責任公司），RAPA和MHY 1485（美國MCE公司），堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司），電泳緩沖液、轉移液、上樣緩沖液、一抗稀釋液和硝酸纖維素膜（NC膜）（深圳子科生物科技有限公司），mTOR、p-mTOR、ALP、Runt相關轉錄因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）和成骨相關轉錄因子Osterix抗體（美國Abcam公司）。倒置顯微鏡和照相系統（日本Olympus公司），CO2細胞培養箱（美國Forma Scientific公司），流式細胞儀、實時熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）儀和酶標儀（美國ThermoFisher公司），細胞超聲破碎儀（寧波新芝超聲電子有限公司），凝膠電泳儀、電泳槽和轉膜槽（美國Bio-Rad公司）。

1.2 細胞培養MC3T 3-E1細胞培養于α-MEM完全培養液中，并將其置于37℃、體積分數為5%CO2的培養箱里培養。每2～3 d更換1次培養液，當細胞密度鋪滿培養皿80%以上時，采用胰蛋白酶消化傳代培養至對數生長期。將MC3T 3-E1細胞消化并按2×104個/孔的密度接種于96孔板和2×106個/孔接種于6孔板。

1.3 CCK-8法檢測各組細胞增殖活性MC3T 3-E1細胞接種于96孔板2 d，RAPA濃度分別為0、10、20、40、60、80、100、120、140、160和180 nmol·L－1，MHY 1485濃 度 分 別 為0、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0和20.0μmol·L－1，每組設5個復孔，培養結束時，每孔加入100μL CCK-8溶液，輕微振動混勻，37℃培養箱內孵育2 h，于酶標儀上檢測450 nm時的吸光度（A）值，以A值代表細胞增殖活性。依據細胞增殖活性曲線的上升、峰值和下降變化趨勢選取適宜濃度RAPA和MHY 1485處理成骨細胞進行后續實驗。

1.4 采用細胞周期檢測試劑盒評估細胞周期將MC3T 3-E1細胞接種于6孔板，分為對照組、20 nmol·L－1RAPA組、60 nmol·L－1RAPA組、160 nmol·L－1RAPA組 和2μmol·L－1MHY 1485組。作用2 d后，將MC3T 3-E1細胞經胰酶消化，收集并采用PBS洗滌。隨后加入70%冷乙醇在4?C恒溫條件下固定過夜，采用PBS將固定液沖洗掉。加入0.4 mL PI染料和0.1 mL RNase A 37℃孵育30 min。再采用流式細胞術測定細胞中DNA水平，分析不同周期細胞百分率。

1.5 RT-qPCR法檢測MC3T 3-E1細胞中目的基因mRNA表達水平MC3T 3-E1細胞接種于6孔板，實驗分組同“1.4”步驟，培養2 d后，胰蛋白酶消化收集細胞，按照TRIzol試劑盒說明書提取總RNA，并采用Nano-Drop分光光度計測定RNA含量。按照試劑盒說明書合成cDNA和PCR擴增。采用StepOnePlus System software導出循環值（Ct）值，采用2－△△Ct法計算目的基因mRNA表達水平。引物序列見表1。

1.6 Western blotting法檢測MC3T 3-E1細胞中目的蛋白表達水平將MC3T 3-E1細胞接種于6孔板，實驗分組同“1.4”步驟，RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，每個泳道加入15μg蛋白后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis， SDSPAGE），電泳后轉至PVDF膜，采用5%脫脂奶粉封閉2 h后，分別加入稀釋后的抗小鼠一抗4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的二抗37℃孵育1 h，增強化學發光法 （enhanced chemiluminescence，ECL）顯影，采用Gel Image System-1600凝膠成像系統采集圖像，分析條帶灰度值。目的蛋白表達水平以目的條帶灰度值/內參條帶灰度值表示。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of primers

1.7 茜素紅染色觀察成骨細胞礦化能力MC3T 3-E1細胞接種于6孔板，實驗分組同“1.4”步驟，培養14 d后進行茜素紅染色。棄去培養基，通過PBS清洗、固定后，加入0.2%茜素紅S染色液，染色30 min，再將染液棄去，洗滌后放入顯微鏡下觀察礦化結節形成情況，以了解成骨細胞礦化程度。

1.8 統計學分析采用SPSS 20.0統計軟件進行統計學分析。各組MC3T 3-E1細胞增殖活性，不同周期細胞百分率，細胞中mTOR、p-mTOR、下游真核翻譯起始因子4E結合蛋白（downstream signals IF4E-binding protein 1，4E-BP1）、磷 酸 化4E-BP1（p-4E-BP1）、核糖體S6激酶1（ribosome protein subunit 6 kinase1，S6K 1）、磷 酸 化S6K 1（p-S6K1）、p62、LC3、B細胞淋巴瘤2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 related X protein，Bax）、Caspase-3、ALP、Runx2和Osterix mRNA和蛋白表達水平均以±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組MC3T 3-E1成骨細胞的增殖活性不同濃度RAPA處理MC3T 3-E1細胞2 d后，與對照組比較，20～100 nmol·L－1PARA組成骨細胞的增殖活性升高（P＜0.05），且濃度超過160 nmol·L－1后RAPA組成骨細胞增殖活性降低更明顯（P＜0.01），可見RAPA對成骨細胞的雙向作用，即低中濃度促進細胞增殖而高濃度抑制細胞增殖，見圖1A。根據檢測結果，選擇20和60 nmol·L－1RAPA作為有效刺激濃度，160 nmol·L－1RAPA作為過度抑制濃度。與對照組比較，高于0.5μmol·L－1MHY 1485作用2 d后抑制成骨細胞增殖活性降低（P＜0.05或P＜0.01），呈濃度依賴性，見圖1B。根據實驗檢測結果，選定2.0μmol·L－1MHY 1485作為后續實驗濃度。

圖1 不同濃度RAPA(A)MHY 1485(B)作用后AMC3T 3-E1成骨細胞的增殖活性Fig.1 Proliferation activities of MC3T 3-E1 osteoblasts after treated with different concentrations of RAPA(A)and MHY 1485(B)

2.2 各組不同細胞周期MC3T 3-E1成骨細胞百分率對照組MC3T 3-E1細胞中G1期細胞占76.12%，S期細胞占13.97%，20和60 nmol·L－1RAPA組G1期（66.40%和53.77%）細胞百分率明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），S期（25.65%和34.58%）細胞百分率明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），即20和60 nmol·L－1RAPA可促進成骨細胞增殖。與對照組比較，160 nmol·L－1RAPA和2.0μmol·L－1MHY 1485組G1期（83.48%和87.26%）細胞百分率升高（P＜0.05），S期（4.44%和4.87%）細胞百分率降低（P＜0.05）。見圖2和3。

2.3 各組MC3T 3-E1成骨細胞中mTOR通路相關蛋白表達水平與對照組比較，20、60和160 nmol·L－1RAPA組MC3T 3-E1細 胞 中 總mTOR、4E-BP1和S6K 1蛋白表達水平無變化，但p-mTOR、p-4E-BP1和p-S6K1蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。與對照組比較，2.0μmol·L－1MHY 1485組MC3T 3-E1成骨細胞中mTOR、p-4E-BP1和p-S6K1蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01）。見圖4和5。

圖2 細胞流式術檢測各組MC3T 3-E1成骨細胞周期分布Fig.2 Distrubution of cell cycels of MC3T 3-E1 osteoblasts in various groups detected by flow cytometry

圖3 各組不同細胞周期MC3T 3-E1成骨細胞百分率Fig.3 Percentages of MC3T 3-E1 osteoblasts at different cell cycles in various groups

圖4 各組MC3T 3-E1成骨細胞中mTOR通路相關蛋白表達電泳圖Fig.4 Electrophoregram of expresssions of mTOR pathway-related proteins in MC3T 3-E1 osteoblasts in various groups

2.4 各組MC3T 3-E1成骨細胞中自噬標志物和凋亡相關因子mRNA和蛋白表達水平與對照組比較，20、60和160 nmol·L－1RAPA組成骨細胞中p62 mRNA和蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01），LC3-Ⅱ表達水平升高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高（P＜0.05或P＜0.01），2.0μmol·L?1MHY 1485組MC3T 3-E1成骨細胞中LC3-Ⅱ和p62 mRNA和蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01），免疫熒光檢測結果也證實了上述結論。與對照組比較，20和60 nmol·L－1RAPA組MC3T 3-E1成骨細胞中促細胞凋亡的Bax mRNA和蛋白及Cleaved-Caspase-3蛋白表達水平降低，抗凋亡的Bcl-2 mRNA和蛋白表達水平升高（P＜0.05或P＜0.01），160 nmol·L－1RAPA和2.0μmol·L－1MHY 1485組MC3T 3-E1成骨細胞中Bax mRNA和蛋白及Cleaved-Caspase-3蛋白表達水平升高（P＜0.01），Bcl-2 mRNA和蛋白表達水平降 低（P＜0.05或P＜0.01）。見 圖6～9。

圖5 各組MC3T 3-E1成骨細胞中mTOR通路相關蛋白的表達水平Fig.5 Expression levels of mTOR pathway-related proteins in MC3T 3-E1 osteoblasts in various groups

圖6 各組MC3T 3-E1成骨細胞中自噬標志物和凋亡相關因子mRNA表達水平Fig.6 Expression levels of autophagy marker and apoptosis-related factor mRNA in MC3T 3-E1 osteoblasts in various groups

圖7 各組MC3T 3E1成骨細胞中自噬標志物和凋亡相關因子蛋白表達電泳圖Fig.7 Electrophoregram of expressions of autophagy marker and apoptosis-related factor proteins in MC3T 3-E1 osteoblasts in various groups

2.5 各組MC3T 3-E1成骨細胞中分化標志物ALP、Osterix和Runx2 mRNA和蛋白表達水平與對照組比較，20和60 nmol·L－1RAPA組MC3T 3-E1成骨細胞中ALP和Runx2 mRNA和蛋白表達水平升高（P＜0.05或P＜0.01），Osterix蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞0.05），160 nmol·L－1RAPA組MC3T 3-E1成 骨 細 胞 中Osterix蛋白表達水平降低（P＜0.05），ALP和Runx2蛋白表達水平降低但差異無統計學意義（P＞0.05），2.0μmol·L－1MHY 1485組MC3T 3-E1成骨細胞中ALP、Osterix和Runx2 mRNA和蛋白表達水平降低（P＜0.01），見圖10～12。茜素紅染色結果顯示：20和60 nmol·L－1RAPA作用12 d后，細胞中可以觀察到明顯的礦化結節，160 nmol·L－1RAPA和2.0μmol·L－1MHY 1485組鏡下細胞數明顯減少，只可見極少數鈣鹽結晶形成。見圖13。

3 討論

mTOR是細胞對抗氧化應激和細胞存活的重要調節因子之一，并且可以被MHY 1485激活以維持線粒體功能［14］。與衰老相關的骨質疏松癥的特征是骨代謝的持續變化，表現為骨形成大于骨吸收。成骨細胞是骨形成的重要功能細胞，通過產生細胞外基質蛋白和基質礦化調節因子，參與早期骨形成和晚期骨重建。自噬是真核細胞的高度保守行為，其與細胞穩態和應激、損傷修復、增殖和分化等密切相關［15］。對細胞自噬的分子研究［16］表明mTOR信號通路是經典的研究通路。體外研究［17］表明：成骨樣細胞自噬的藥理學誘導可降低其氧化應激，抑制細胞凋亡。年齡相關的骨量丟失和骨氧化應激水平的逐漸升高，均與骨質疏松患者外周血中mTOR活性有關［18］。成骨細胞凋亡受多種信號通路的調節。在哺乳動物中Bcl-2基因及其相關蛋白在細胞凋亡調控過程中起重要作用。Bcl-2可以阻止細胞凋亡并使細胞壽命延長，而Bax與Bcl-2形成異源二聚體，通過抑制Bcl-2發揮促細胞凋亡作用［19］。Caspase-3活化為Cleaved-Caspase-3后可引起細胞凋亡，這個過程可以被Bcl-2阻斷［20］。本研究結果顯示：20和60 nmol·L－1RAPA組成骨細胞中mTOR及其下游通路p-4E-BP1和p-S6K 1水平明顯降低，誘導成骨細胞從DNA合成前期進入DNA合成期，促進抗凋亡基因Bcl-2的表達和細胞增 殖，而160 nmol·L－1RAPA組 成 骨 細 胞 中p-mTOR水平降低、2.0μmol·L－1MHY 1485組成骨細胞中p-mTOR、p-4E-BP1和p-S6K 1水平明顯升高，表現為阻止成骨細胞分裂使細胞周期停留在DNA合成期，誘導凋亡基因Bax和Cleaved-Caspase-3的表達，從而促進成骨細胞的凋亡，說明適度抑制mTOR的磷酸化有助于成骨細胞增殖，而過度抑制或激活mTOR通路則促進成骨細胞凋亡。

圖8 各組MC3T 3-E1成骨細胞中自噬標志物和凋亡相關因子蛋白的表達水平Fig.8 Expression levels of autophagy marker and apoptosis-related factor proteins in MC3T 3-E1 osteoblasts in various groups

圖9 免疫熒光法檢測各組MC3T 3-E1成骨細胞中K LC3-Ⅱ蛋白的表達(Bar=50μm)Fig.9 Expressions of LC3-Ⅱprotein in MC3T 3-E1 osteoblasts in various groups detected by immunofluorescence method(Bar=50μm)

LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值可反映自噬流的產生狀態。脂化后的LC3會從LC3-Ⅰ轉化為LC3-Ⅱ，脂化的LC3-Ⅱ被認為是自噬小體形成的標志物［21］。p62可作為將要被自噬作用降解的小泡的受體，也可作為要被清除的泛素化蛋白聚集物的受體。p62蛋白可結合泛素，也可與LC3結合，從而靶向自噬體并促進泛素化蛋白的清除［22］。本研究結果證實：RAPA抑制p62的表達可提升LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，免疫熒光實驗結果證實在RAPA作用下LC3-Ⅱ表達明顯增強，說明RAPA可激活成骨細胞內自噬，而MHY 1485通過抑制自噬體降解導致LC3-Ⅱ堆積，增強p62表達而抑制自噬。

ALP是反映骨形成的血清標志物，與成骨細胞和破骨細胞活性的變化有關。Osterix是與成骨細胞分化和骨形成有關的轉錄因子，只在發育的骨組織中呈特異性表達。Runx2是在誘導不成熟骨細胞向成熟的成骨細胞分化過程中起重要作用的轉錄因子［23］。ALP、Osterix和Runx2均可作為骨轉化的標記蛋白，與骨吸收、骨形成和骨礦化密切相關［24］。本研究結果顯示：20和60 nmol·L－1RAPA適度抑制mTOR的磷酸化時，ALP、Osterix和Runx2表達明顯增強，同時可促進晚期礦化結節的形成，而160 nmol·L－1RAPA過度抑制mTOR的磷酸化并未明顯改變成骨活性。MHY 1485增強mTOR磷酸化，并從基因和蛋白水平抑制ALP、Osterix和Runx2的表達，降低了成骨細胞晚期礦化能力；提示適度抑制mTOR的磷酸化在早期和晚期均可促進成骨細胞分化，增強成骨活性，而過度抑制和激活mTOR則可抑制成骨分化，而該結果的出現可能與不同條件下自噬的變化相關。研究［25］表明：通過調控mTOR過度抑制自噬或自噬過強均可導致細胞凋亡，但在成骨細胞中此機制尚未闡明，后續實驗會將結論進行進一步驗證。

圖10 各組MC3T 3-E1成骨細胞中Runx2(A)、Osterix(B)和ALP(C)表達水平Fig.10 Expression levels of Runx2(A),Osterix(B),and ALP(C)mRNA in MC3T 3-E1 osteoblasts in various groups

圖11 各組MC3T 3-E1成骨細胞中ALP、Osterix和Runx2蛋白表達電泳圖Fig.11 Electrophoregram of expressions of ALP,Osterix,and Runx2 proteins in MC3T 3-E1 osteoblasts in various groups

圖12 各組MC3T 3-E1成骨細胞中Runx2(A)、Osterix(B)和ALP(C)蛋白表達水平Fig.12 Expression levels of Runx2(A)，Osterix(B)，and ALP(C)proteins in MC3T 3-E1 osteoblasts in various groups

圖13 茜素紅染色觀察各組MC3T 3-E1成骨細胞礦化情況(Bar=50μm)Fig.13 Mineralization of MC3T 3-E1 osteoblasts in various groups detected by Alizarin red staining(Bar=50μm)

mTOR通過對各種骨相關細胞的活性和功能進行調控，影響骨代謝過程，其中涉及多種信號分子的調節，在骨組織代謝過程中起到重要作用。研究［23］顯示：mTOR的抑制并不完全有利于骨量調節，接近極值的水平可能會影響細胞的基礎功能，從而呈現相反結果，且在細胞生長和分化不同階段的自噬水平也不一致。本研究結果顯示：適宜濃度RAPA可以通過抑制mTOR活性，增強成骨細胞的增殖活性和分化能力，而過度抑制或激活mTOR則會誘導成骨細胞凋亡，減弱成骨細胞分化功能。本課題組將進行進一步的臨床研究以確認mTOR與骨質疏松癥之間可能存在的關系，為開發預防和治療骨質疏松癥的方法提供實驗依據。