小米糠多酚提取工藝的研究

李曉君 張 梅 張建豐 張紅嬌 丁東源 譚永蘭 渠志燦

(中北大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院1，太原 030051)(山西納安生物科技股份有限公司2，太原 030006)

我國(guó)谷子的年種植面積約140萬ha，產(chǎn)量450萬t。小米糠是谷子加工產(chǎn)生的副產(chǎn)物，年產(chǎn)量約30萬t[1]，不僅含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且富含黃酮、多酚等生物活性物質(zhì)，有助于延緩衰老[2,3]、預(yù)防疾病[4]。目前，小米糠小部分被制成家畜飼料，大部分則直接廢棄，不僅造成了環(huán)境污染，還造成了資源的浪費(fèi)[5]，所以開發(fā)利用小米糠有著重要的意義和廣闊的前景[6,7]。

小米糠的酚類化合物具有很強(qiáng)的抗氧化活性，可有效預(yù)防癌癥、心血管疾病、阿茨海默病及糖尿病等[8，9]。延莎等[10]研究發(fā)現(xiàn)，不同品種小米糠以晉谷21號(hào)小米多酚抗氧化能力最強(qiáng)，且多酚含量與抗氧化能力呈顯著相關(guān)性。山西省沁縣為小米的傳統(tǒng)種植區(qū)，其獨(dú)特的地理和氣候生產(chǎn)的小米品質(zhì)優(yōu)良，小米更是當(dāng)?shù)乩习傩盏闹饕杖雭碓础?/p>

本實(shí)驗(yàn)以山西省沁縣的晉谷21號(hào)小米糠為原料，通過比較不同提取方法對(duì)小米糠多酚得率的影響，并對(duì)優(yōu)選出的方法采用單因素結(jié)合響應(yīng)面輔助的方法對(duì)其提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，同時(shí)對(duì)小米糠提取物的化學(xué)成分及抗氧化活性進(jìn)行了分析和測(cè)試，為小米糠的綜合開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

小米糠原料采自于山西省沁縣，由中北大學(xué)生物工程專業(yè)實(shí)驗(yàn)室提供，小米糠過20目篩后備用。

1.2 主要藥品及試劑

石油醚、無水乙醇、甲醇、抗壞血酸，均為分析純；沒食子酸、DPPH標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3 主要儀器設(shè)備

DHG-9023A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；SOX406索式粗脂肪提取儀；JH-14-04可見分光光度計(jì)；JP-040超聲波清洗機(jī)； Ultimate3000高分辨質(zhì)譜；EG823CDA-NR美的微波爐。

1.4 五種方法提取小米糠粗提物中的多酚

1.4.1 脫脂

將小米米糠去雜、磨碎、過篩，稱取一定量小米糠粉，按料液比1∶10加入石油醚索式抽提得到小米米糠脫脂產(chǎn)物，4 ℃下儲(chǔ)藏備用。

1.4.2 超聲波提取法(UE)

稱取5 g 脫脂小米糠，按料液比1∶10加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇，在 50 ℃、300 W 條件下超聲波提取40 min。抽濾得到提取液1，準(zhǔn)確量取濾液體積，將濾渣按料液比1∶6重新加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇，超聲條件不變，結(jié)束后抽濾得提取液2，合并兩次提取液，記錄提取液總體積。

1.4.3 冷浸提取法(CSE)

小米糠與乙醇混合物(料液比1∶10，下同)在常溫條件下浸泡 24 h(每隔30 min搖晃一次錐形瓶，盡量使其完全反應(yīng))，其他條件與超聲波提取處理相同均為兩次提取，下同。

1.4.4 熱回流法提取法(HRE)

小米糠與乙醇混合物在80 ℃ 條件下進(jìn)行熱回流提取80 min，其他條件與超聲波提取處理相同。

1.4.5 閃式提取法(FE)

小米糠粉碎過80目篩，然后與乙醇混合物以12 000 r/min提取1 min，其他條件與超聲波提取處理相同。

1.4.6 微波提取法(ME)

小米糠與乙醇混合物放入微波爐每隔20 s間歇微波提取 1 min，微波功率800 W，其他條件與超聲波提取處理相同。

1.4.7 多酚得率的測(cè)定

參考何志勇等[11]方法，以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：y=1.313 1x-0.028 5 ，R2=0.996 7，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算上清液中多酚的含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

結(jié)合1.4.1，計(jì)算多酚得率X：

(1)

式中：Y為提取液中多酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%；V為提取液的總體積/mL；M為小米糠原料的質(zhì)量/g。

1.4.8 多酚清除DPPH·能力測(cè)定

用甲醇將多酚提取物樣品稀釋至不同濃度，每個(gè)濃度的樣品取0.3 mL 加入試管中，加入2.7 mL 60 μmol/L的DPPH甲醇溶液，室溫避光反應(yīng)30 min，于518 nm 處測(cè)定吸光度值。以含有0.3 mL甲醇和2.7 mL DPPH 溶液為空白樣品，以VC作為陽性對(duì)照，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)式(2)計(jì)算 DPPH· 清除率。

(2)

式中：A0為DPPH 空白對(duì)照的吸光度值；AS為樣品與 DPPH 反應(yīng)后的吸光度值。

1.5 小米糠多酚提取工藝優(yōu)化

考慮到超聲提取小米糠多酚得率最高且同等條件下抗氧化能力較強(qiáng)，因此選擇超聲提取進(jìn)行單因素及響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

1.5.1 單因素實(shí)驗(yàn)

稱取小米糠 5.0 g 于錐形瓶中，在多組預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取料液比(1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14 g/mL)、顆粒度(10、20、40、60、80 目)、提取溫度(20、30、40、50、60 ℃)、提取時(shí)間(20、30、40、50、60 min)、超聲功率(180、210、240、270、300 W)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%、60%、70%、80%、90%)，考察各單因素在超聲波輔助提取時(shí)對(duì)多酚得率的影響。料液比1∶10(g/mL)、顆粒度40目、提取溫度50 ℃、提取時(shí)間40 min、超聲功率240 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%為每個(gè)單因素除自身以外的固定值。

1.5.2 響應(yīng)面優(yōu)化

通過單因素實(shí)驗(yàn)中各因素對(duì)小米糠多酚得率的影響，選取料液比、顆粒度、提取溫度、提取時(shí)間4種影響較大的因素為自變量，多酚得率為因變量，利用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，響應(yīng)面因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表

1.6 小米糠多酚組成分析

1.6.1 色譜條件

色譜柱：Innovation Ultimate C18反相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流速0.2 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量2 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)325 nm；流動(dòng)相A水/甲酸=99.5/0.5；流動(dòng)相B為水/乙腈/甲酸=19.5/80/0.5。

流動(dòng)相洗脫程序：50 min內(nèi)B由6%升高至50%；5 min內(nèi)B由50%降低至6%；6% B維持5 min，共60 min。

1.6.2 質(zhì)譜條件

離子源(ESI)噴霧電壓3 500 V；(-)離子模式掃描；質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 000；干燥氣和霧化氣為氮?dú)猓桓稍餁饬? mL/min；霧化氣壓力40.0 psi；離子源溫度 300 ℃。

1.7 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，使用Origin2019繪圖，使用SPSS22.0進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種提取方法對(duì)多酚得率及清除DPPH·能力影響

2.1.1 多酚得率

由圖1得出，UE(超聲波提取)的得率顯著高于其他4種提取方法(P<0.05)；CSE(冷提法)和FE(閃提法)與ME(微波法)和HRE(熱回流)比較，多酚得率偏高，且無顯著性差異(P>0.05)，原因可能是CSE和FE的提取溫度遠(yuǎn)低于ME和HRE時(shí)的提取溫度，溫度較高會(huì)導(dǎo)致多酚類物質(zhì)受熱分解，得率下降。又因UE操作方便，提取條件可控制性強(qiáng)，多酚得率較高，所以選擇UE進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖1 5種提取方法對(duì)小米糠多酚得率的影響

2.1.2 DPPH·清除率

由圖2可知，其中超聲波提取時(shí)提取物對(duì)DPPH·的清除率在2.5 g/L時(shí)可達(dá)51.57%，顯著高于同等濃度的其他4種方法提取物(P<0.05)，但均低于VC標(biāo)準(zhǔn)物的清除率。且超聲波提取的提取物濃度在6.0 g/L時(shí)對(duì)DPPH·的清除率達(dá)到80.45 %，顯著高于其他提取物在此濃度時(shí)的清除率(P<0.05)，又因超聲提取具有操作方便、條件易于控制、節(jié)能環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，所以選擇超聲波提取效果最佳。

圖2 5種提取方法對(duì)小米糠多酚清除DPPH·的影響

2.2 小米糠多酚提取工藝

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

由圖3可以得出，隨著料液比的增大，多酚得率呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，在料液比為1∶10時(shí)得率最高，為1.703%，與另外4種料液比多酚得率相比差異顯著(P<0.05)；當(dāng)料液比繼續(xù)增大時(shí)，多酚得率反而降低，這可能由于多酚提取物的氧化導(dǎo)致，料液比1∶12和1∶14相比多酚得率差異不顯著。研究表明，提取原料和提取溶劑的濃度梯度是提取物溶出的動(dòng)力，較大的濃度梯度有助于提取物的溶出，但當(dāng)此濃度梯度達(dá)到一定限度時(shí)，繼續(xù)增加濃度梯度對(duì)提取物的溶出反而起抑制作用[12]，因此料液比選擇1∶10 g/mL最適宜。

圖3 各因素對(duì)小米糠多酚得率的影響

隨著樣品顆粒的減小，多酚得率越無顯著性差異，顆粒度為10、80目及20、60目時(shí)多酚得率沒有顯著性差異(P>0.05)，但顯著低于顆粒度為40目時(shí)的多酚得率(P<0.05)，為1.709%，這可能是因?yàn)樵谝欢舛葍?nèi)，隨著樣品顆粒的減小，物料與溶劑接觸更加充分，從而增加了傳質(zhì)效率，有利于小米糠醇溶性提取物的提取，當(dāng)樣品顆粒繼續(xù)減小，多酚得率反而降低，這可能是因?yàn)闃悠奉w粒過小堵塞濾紙，導(dǎo)致濾液損失，得率降低。因此顆粒度選擇40目最適宜。

提取溫度是小米糠多酚提取過程中重要的影響因素，在料液比、顆粒度、提取時(shí)間、超聲功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)不變的條件下，多酚得率在一定范圍內(nèi)隨溫度的升高而增加，但當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，得率達(dá)到最高，顯著高于其他4個(gè)提取溫度(P<0.05)，繼續(xù)升高溫度多酚的得率反而下降，可能是由于溫度的升高，破壞了多酚的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致得率下降，因此提取選擇溫度選擇50 ℃最適宜。

由圖3可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)多酚得率先升高后降低。提取時(shí)間為40 min時(shí)多酚得率顯著高于其他提取時(shí)間(P<0.05)，為1.766%，當(dāng)提取時(shí)間再增加，多酚得率反而下降，這可能是因?yàn)槎喾右呀?jīng)完全溶出，提取時(shí)間再增長(zhǎng)，多酚得率不會(huì)再增加，還可能會(huì)由于熱效應(yīng)導(dǎo)致其氧化分解成其他物質(zhì)以至于得率下降，因此提取時(shí)間選擇40 min最適宜。

由圖3可以看出，超聲功率對(duì)多酚得率的影響較小，表現(xiàn)為曲線平緩，且5個(gè)功率下多酚得率并無顯著性差異(P>0.05)且5種乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)小米糠多酚得率無顯著性影響(P>0.05)。

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化

通過軟件計(jì)算分析，得到4個(gè)實(shí)驗(yàn)因素影響1個(gè)響應(yīng)值的數(shù)學(xué)模擬方程，見表2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.2.2.1 響應(yīng)因子顯著性分析及方程擬合效果分析

對(duì)表3中的因子進(jìn)行回歸擬合，得到回歸方程：R(%)=1.54-0.026A-0.003B-0.00423C+0.00853D+0.017AB+0.007AC-0.035AD+0.02BC-0.00325BD-0.007CD-0.029A2+0.031B2+0.046C2+0.069D2。

表3 響應(yīng)面模型回歸方程的方差分析

2.2.2.2 交互作用影響結(jié)果

由響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果可知，液料比和顆粒度、提取溫度、提取時(shí)間之間的交互關(guān)系非常顯著，顆粒度和提取溫度、提取時(shí)間以及提取溫度和提取時(shí)間之間的交互交互關(guān)系較為顯著。4個(gè)因素對(duì)多酚得率都有一定的影響作用，這與回歸方差分析結(jié)果相吻合。

2.2.2.3 最優(yōu)方法驗(yàn)證

獲得小米糠多酚超聲提取最佳工藝條件為液料比9.83 mL/g、 顆粒度58.46目、提取溫度48.20 ℃、提取時(shí)間48.05 min，多酚得率為1.742%。考慮到實(shí)際應(yīng)用過程中操作簡(jiǎn)便，將工藝條件修正為液料比10∶1 mL/g、顆粒度60目、提取溫度48 ℃、提取時(shí)間48 min，在此最佳條件下，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，得到多酚得率均值為1.726%，與預(yù)測(cè)值偏差0.91%，表明該模型能較好的預(yù)測(cè)多酚得率。

2.3 最佳條件下小米糠多酚清除DPPH·能力

如圖4所示，最佳工藝條件下提取得到的小米糠多酚清除DPPH·的能力隨提物濃度的增加而增大，當(dāng)提取物濃度為6 g/L時(shí)小米糠多酚的清除能力可達(dá)82.50%，但顯著低于同等濃度下VC的清除率93.26%(P<0.05)，為小米糠的綜合開發(fā)利用提供了依據(jù)。

圖4 最佳工藝條件下小米糠多酚清除DPPH·能力

2.4 小米糠多酚組成鑒定結(jié)果

通過小米糠多酚化合物的離子流色譜圖，采用 HPLC-ESI-MS 進(jìn)行定性分析，實(shí)驗(yàn)質(zhì)譜分析采用(-)離子模式，各小米米糠多酚化合物的相對(duì)分子質(zhì)量即為質(zhì)荷比值(m/z)加1，由此得到小米米糠多酚中各化合物的分子量。通過與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)告進(jìn)行比對(duì)，并參考國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，可初步推斷小米糠多酚組成成分。主要峰所對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖見圖5、圖6，采用質(zhì)譜分析方法，通過高分辨質(zhì)譜擬合的分子式，對(duì)其質(zhì)荷比和分子量進(jìn)行了測(cè)定。

圖5 小米糠多酚A物質(zhì)的質(zhì)譜

圖6 小米糠多酚B物質(zhì)的質(zhì)譜圖

根據(jù)圖5、圖7可知，物質(zhì) A 的保留時(shí)間為10.34 min，質(zhì)荷比(m/z)為329.23，高分辨質(zhì)譜擬合的分子式為C14H18O9，根據(jù)數(shù)據(jù)庫檢索和文獻(xiàn)報(bào)道[13]，推測(cè)該化合物為香草酸-4-O-β-D-葡萄糖苷。

圖7 小米糠多酚液質(zhì)聯(lián)用色譜圖

根據(jù)圖6、圖7可知，物質(zhì)B的保留時(shí)間為10.78 min，質(zhì)荷比(m/z)為207.14，高分辨質(zhì)譜擬合的分子式為C11H12O4，根據(jù)數(shù)據(jù)庫檢索文獻(xiàn)報(bào)道[14],推測(cè)該化合物為阿魏酸甲酯。

3 結(jié)論

5種提取方法中，采用超聲提取得到的小米糠多酚得率最高，為1.55%；小米糠多酚濃度為6 g/L時(shí)對(duì)DPPH·的清除率可達(dá)80.45%；通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化得到的小米糠多酚最佳提取工藝條件為：液料比10∶1 mL/g、顆粒度60目、提取溫度48 ℃、提取時(shí)間48 min 、超聲功率240 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，在此條件下小米糠多酚得率為1.726%，且在多酚濃度為6 g/L時(shí)對(duì)DPPH·的清除率提高了2.05%；HPLC-ESI-MS結(jié)果表明，小米糠多酚中含有香草酸-4-O-β-D-葡萄糖苷和阿魏酸甲酯。小米糠不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，且富含多酚等抗氧化活性物質(zhì)，具有開發(fā)為一種新型抗氧化劑的潛力。