甘薯塊根淀粉酶特性及糖化效應研究

項 超 沈升法 吳列洪 李 兵 羅志高

(浙江省農業科學院作物與核技術利用研究所，杭州 310021)

甘薯[Ipomoeabatatas(L.) Lam.]是中國重要的糧食作物[1]。近年來，隨著人們生活水平的提高和對消費需求的不斷改變，鮮食的消費比例持續增加，甘薯加工產品呈現多樣化、營養化、細分化以及休閑食品銷量逐步上升等趨勢，對優質鮮食甘薯和加工專用品種的需求日益增長[2]。甘薯塊根富含淀粉和淀粉酶，α-淀粉酶和β-淀粉酶是促進淀粉分解的主要酶[3,4]。其中，α-淀粉酶將淀粉分子的α-1,4糖苷鍵任意切斷成長短不一的短鏈糊精及少量的麥芽糖和葡萄糖，β-淀粉酶可以從淀粉的非還原性末端降解α-1,4糖苷鍵，生成麥芽糖[4]。淀粉酶的活性是決定淀粉糖化程度主要因素，也是甘薯品質的重要指標之一[5]。

甘薯品種的糖化特性存在基因型差異，具體表現在淀粉率、可溶性糖含量、還原糖含量和淀粉酶活性等指標的差異[3-9]。史春余等[4]研究表明食用型品種塊根膨大后期，由于淀粉酶的作用導致薯塊總淀粉含量較低、可溶性總糖含量較高。陳顯讓等[6]研究發現在塊根膨大后期，β-淀粉酶和總淀粉含量多數呈顯著的負相關，可以為選擇提取β-淀粉酶的優質甘薯來源提供參考。陸國權等[7]研究表明不同干率類型的甘薯品種間淀粉酶活性存在差異，高干型、低干型與中干型品種淀粉酶活性存在極顯著差異。謝逸萍等[8]報道了不同基因型品種淀粉率在整個貯藏期均有所下降, 不同淀粉含量品種的淀粉酶活性存在明顯差異。不同品種間塊根淀粉酶活性的差異可能預示著其塊根中淀粉水解所需的最低淀粉酶活性是不同的，這與淀粉糊化和相關淀粉酶活性保持條件有關[4, 10-14]。Mensah等[12]研究發現β-淀粉酶活性受溫度、基因型、加熱時間以及基因型與溫度交互作用影響，升溫和延長加熱時間通常會降低β-淀粉酶的活性并導致糖分的變化。

隨著鮮食甘薯消費需求和加工原料需求的變化，提前在夏季或高溫季節陸續進行甘薯收獲，但一般此時鮮薯糖分結累少、甜度低，其淀粉酶活性可能還不足以促進淀粉的迅速水解[4]。關于夏季或高溫季節收獲的甘薯淀粉酶糖化特性及不同類型內源淀粉酶活性保持條件的研究鮮有報道。因此，本實驗通過測定甘薯在蒸煮熟化前后其塊根中可溶性糖、還原糖含量以及不同類型淀粉酶活性變化，開展淀粉酶對甘薯淀粉的酶解特性研究，并進行生淀粉體外糖化的分析，不僅為系統了解加工過程中甘薯淀粉酶特性及糖化效應，而且為篩選鮮食或加工專用品種，有效開發甘薯資源，提高其加工產品質量、功能及其營養價值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試甘薯材料為浙薯13、浙薯75和浙薯33；葡萄糖標準溶液(1.0 mg/mL)、硫酸銅、亞甲藍、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、鹽酸,均為分析純；超純水；α-淀粉酶測定的K-CERA試劑盒、β-淀粉酶測定的K-BETA3試劑盒。

1.2 儀器與設備

C21-SK2108多功能電磁爐(蒸煮模式，1 100 W)，DKS-24恒溫水浴鍋，DS-1高速組織搗碎機，Eppendorf Centrifuge 5810R離心機，752紫外可見分光光度計。

1.3 方法

1.3.1 薯塊樣品處理

薯塊于8月15日(夏季)收獲，生育期109 d。選取3個中等大小(250 g左右)的新鮮薯塊，每個薯塊為一個重復，橫向中間對切，其中半個薯塊用電磁爐隔水蒸煮1 h，鮮薯蒸熟后冷卻至室溫，切除切面1 cm左右薯肉，從整個橫切面均勻刮取1.0 g薯泥樣品，用于熟薯糖分的測定；另外半個薯塊從橫切面均勻刮取兩份1.0 g薯泥樣品，分別用于淀粉酶及生薯糖分的測定。

1.3.2 還原糖和可溶性糖含量的測定

參照GB/T 5009.7—2016直接滴定，對生薯和熟薯樣品進行還原糖和可溶性糖含量測定。取已備好的生薯和熟薯樣品各1.0 g，分別加水9 mL，置于60 ℃恒溫水浴中保溫2 h，冷卻后以1 789 g速度離心10 min，各吸取上清液6 mL，每份上清液平均分成兩份，一份用于還原糖含量測定，另一份加入6 mol/L鹽酸在68 ℃水解后用于可溶性糖含量測定。

1.3.3 淀粉酶活性的測定

采用K-CERA和K-BETA3試劑盒分別測定α-淀粉酶[14,15]和β-淀粉酶活性[14,16]。取1.0 g鮮薯樣品，加入1 mL提取緩沖劑進行研磨，再加入4 mL提取緩沖劑分三次對研磨的鮮薯樣品進行沖洗并轉移到15 mL塑料離心管中，以447 g速度離心10 min，吸取上清液0.2 mL，然后加入0.2 mL α-淀粉酶測定反應底物，置于40 ℃恒溫水浴中保溫10 min，加3 mL終止液，在400 nm處測定吸光度值。取0.2 mL上清液，加入3 mL稀釋緩沖液進行稀釋，從中吸取0.2 mL溶液，然后加入0.2 mL β-淀粉酶測定反應底物，置于40 ℃恒溫水浴中保溫10 min，加3 mL終止液，在400 nm處測定吸光度值。其中待測酶液和底物，均事先置于40 ℃恒溫水浴中保溫5 min。測完后按照試劑盒提供的計算公式及稀釋倍數，換算成以鮮薯計算的酶活性單位(U)。

1.3.4 淀粉酶熱穩定性的測定

參考淀粉酶活性測定方法，分別測定樣品在50、60、70、80、90 ℃時的酶活性，由于品種間及不同溫度下酶活性差距大，需要調整適當的稀釋倍數，確保吸光度在量程范圍內，再按各自的稀釋倍數，統一轉換到淀粉酶活性測定的標準稀釋倍數下的吸光度。其中β-淀粉酶熱穩定性測定增加75 ℃的處理。參考淀粉酶活性測定方法，在60 、70 、75 、80 ℃條件下測定20 min內每2 min時的β-淀粉酶活性，以標準稀釋倍數下的吸光度來表示。

1.3.5 生淀粉體外糖化的測定

選取3個品種的新鮮薯塊，切絲后用高速組織搗碎機搗碎后，使用清水沖洗，180目篩網過濾2次，所得濾液以447 g速度離心10 min，棄上清液得到淀粉。稱取新鮮濕淀粉0.20 g置于15 mL塑料離心管，加入1.3.3中的上清液0.4 mL和5 mL蒸餾水，置于75 ℃水浴鍋，并控制水浴鍋在15 min左右升到85 ℃，期間不斷振蕩離心管。達到85 ℃后迅速取出，置入冷水中冷卻。以加入5.4 mL蒸餾水為對照，測定反應產生的還原糖含量，換算成以鮮薯計的還原糖含量。

1.3.6 數據統計與分析

3次重復實驗數據采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，其中組間平均值比較采用Duncan分析(P<0.05)。

2 結果與討論

2.1 β-淀粉酶活性變化

對3個甘薯品種的β-淀粉酶活性進行多因素實驗的方差分析(表1)，結果表明，甘薯塊根中β-淀粉酶活性高低受品種、加熱溫度和保溫時間極顯著的影響，也取決于品種和反應條件(包括溫度和時間)之間的相互作用。其中，加熱溫度占總方差比例最大。

表1 加熱溫度和保溫時間對不同甘薯品種塊根中β-淀粉酶活性的影響

當加熱溫度高于酶的最適溫度時，酶的活性就會逐漸失去；隨著加熱時間的延長，薯塊中淀粉酶的失活率升高，并且這個過程是不可逆的。因此，適宜的加熱溫度和保溫時間，在保持甘薯淀粉酶活性的穩定性方面發揮著至關重要的作用。溫度對β-淀粉酶活性的影響由圖1所示，3個甘薯品種的β-淀粉酶活性在不同溫度條件下變化趨勢基本一致，變化的程度有所不同。當溫度低于60 ℃時，β-淀粉酶活性隨溫度的升高而增大；當溫度高于60 ℃時，β-淀粉酶活性隨著溫度的升高呈下降趨勢。供試品種在60 ℃溫度條件下可以較好地保持甘薯淀粉酶活性，與前人研究結果基本一致[14,17]。β-淀粉酶不能水解天然淀粉，能水解糊化的甘薯淀粉[14]。本研究中β-淀粉酶在75 ℃和80 ℃仍有較強的活性，80 ℃時其糖化能力已經大大降低，說明其不能耐受80 ℃以上的高溫。在70～90 ℃范圍內，浙薯13的β-淀粉酶活性下降幅度顯著小于浙薯33，與浙薯75無顯著差異；說明浙薯13的β-淀粉酶熱穩定性較強。當反應溫度一定時，在保溫時間在20 min以內時，β-淀粉酶活性總體上都是隨保溫時間延長而增大；當溫度高于60 ℃時，糖化速度隨保溫時間的延長呈下降趨勢，β-淀粉酶活性趨于平穩(圖2)。另外，對3個甘薯品種之間比較分析發現，浙薯33的淀粉酶活性在同樣反應條件下最高，浙薯13次之，浙薯75最低。與保溫時間和品種兩個因素相比，溫度是影響β-淀粉酶活性的主要因素。因此，在甘薯蒸煮食用及其產品加工過程中應嚴格控制加熱的溫度。

圖1 不同溫度條件下β-淀粉酶活性變化

圖2 不同溫度及不同加熱時間處理對三個品種甘薯β-淀粉酶熱穩定性的影響

3個甘薯品種中，浙薯13和浙薯33能夠很好地保持其中的淀粉酶活性，浙薯13的耐熱性更強。浙薯13和浙薯33因含有相對較高的β-淀粉水解潛力使其成為薯脯干加工的良好原料。

2.2 α-淀粉酶活性變化

方差分析結果表明，甘薯塊根中α-淀粉酶活性不僅受品種和加熱溫度極顯著的影響，而且受品種與加熱溫度之間互作效應極顯著的影響(表2)。其中，加熱溫度占總方差比例最大。與品種相比，加熱溫度是影響α-淀粉酶活性的主要因素。溫度對α-淀粉酶活性的影響由圖3所示，α-淀粉酶活性隨溫度的升高而下降；當溫度高于50 ℃時，其糖化能力已經大大降低；在50～70 ℃范圍內，3個品種的α-淀粉酶活性均大幅下降，其中浙薯13的α-淀粉酶活性下降幅度最小且顯著低于浙薯75，與浙薯33下降幅度無明顯差異。當溫度超過80 ℃時，酶開始變性失活，從而抑制了糖化反應的進行。3個甘薯品種的α-淀粉酶活性在不同溫度條件下變化趨勢基本一致，變化的程度有所不同。對圖1和圖3的結果進行比較可以發現，各品種塊根中α-淀粉酶活性都遠低于β-淀粉酶活性，這與前人的研究結果一致。

表2 加熱溫度對不同甘薯品種塊根中α-淀粉酶活性的影響

圖3 不同溫度條件下α-淀粉酶活性變化

2.3 還原糖、可溶性糖含量變化

β-淀粉酶催化可溶性淀粉向糖的轉化，從而增加了游離糖的組成和加工產品的甜度[12]。從圖4可以看出，不同品種在蒸煮之后的可溶性糖和還原糖含量均顯著增加，且還原糖含量的增幅較可溶性糖含量更大。不同品種間熟薯可溶性糖含量和還原糖含量均存在顯著差異；可溶性糖含量和還原糖含量的增量和增幅均是浙薯33最大，浙薯13次之，浙薯75最小。以上結果可以推斷，甘薯蒸煮過程中，達到淀粉糊化溫度后，β-淀粉酶仍存在較大活性，對糊化淀粉的糖化作用導致甘薯蒸煮過程中糖分的變化[5,18-20]。進一步的生淀粉體外糖化實驗證明，在75～85 ℃條件下，以還原糖含量為指標，含β-淀粉酶的甘薯提取液能使生淀粉在糊化的同時實現糖化。β-淀粉酶活性高的品種，其糖化產率，即還原糖含量也相應較高。夏季或高溫季節進行甘薯收獲時，鮮薯糖分結累少，甜度低，而β-淀粉酶能在蒸煮過程中大幅度增加糖分，因此選擇β-淀粉酶活性高、熱穩定性好的品種，適合夏季收獲，作為鮮食或加工品種應用。

注：同一類型的糖分柱上不同字母的表示處理間差異顯著(P<0.05)。圖4 不同品種蒸煮前后糖分變化

注：不同字母的表示處理間差異顯著(P< 0.05)。圖5 生淀粉體外糖化結果

在適宜條件下，α-淀粉酶隨機作用于淀粉鏈內部的α-1,4-糖苷鍵，產物是糊精及少量的麥芽糖和葡萄糖；β-淀粉酶可以從淀粉的非還原性末端降解α-1,4-糖苷鍵，生成麥芽糖[4]?；谝陨献饔脵C理，Mensah等[12]的實驗結果表明，α-淀粉酶和β-淀粉酶水解淀粉存在很好的協同作用。甘薯塊根中含有一定量的α-淀粉酶，在高溫下，它的存在可能增強了淀粉向麥芽糖的轉化，而升溫和增加加熱時間通常會降低β-淀粉酶的活性并增強麥芽糖的形成[10]。本研究中β-淀粉酶的最佳溫度在60 ℃左右，加熱到75 ℃仍可保留相對較高比例的內源淀粉酶[12,21]。因此，較高溫度下還原糖含量的差異可能是由于α-淀粉酶和β-淀粉酶的協同作用。

3 結論

甘薯塊根中β-淀粉酶活性受品種、加熱溫度和保溫時間極顯著的影響；與保溫時間和品種這兩個因素相比，溫度是影響β-淀粉酶活性的主要因素。甘薯塊根中α-淀粉酶活性受品種、加熱溫度以及兩者之間互作效應極顯著的影響；與品種相比，加熱溫度是影響α-淀粉酶活性的主要因素。因此，在甘薯蒸煮食用及其產品加工過程中應嚴格控制加熱的溫度。3個甘薯品種中，浙薯13和浙薯33能夠很好地保持其中的β-淀粉酶活性，浙薯13的耐熱性更強。β-淀粉酶活性高的品種，其糖化產率也相對較高。甘薯品種浙薯13和浙薯33因含有相對較高的β-淀粉水解潛力和耐熱性，適合在夏季或高溫季節收獲作為鮮食和加工的良好原料。