酶解玉米醇溶蛋白-葉黃素納米粒的制備、結(jié)構(gòu)表征及體外抗氧化和釋放特性研究

韓 赫 焦 巖,2 常 影 石 磊 劉志宇 楊又彬

(齊齊哈爾大學(xué)，食品與生物工程學(xué)院1，齊齊哈爾 161006)(黑龍江省玉米深加工理論與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2，齊齊哈爾 161006)

葉黃素是一種類胡蘿卜素，廣泛存在于綠色植物中[1]，是一種脂溶性功能成分，具有抗氧化、抗輻射和預(yù)防癌癥等生理功能[2]，還可以保護(hù)視力及減少眼部黃斑變性等疾病(AMD)的發(fā)生[3]。但是由于葉黃素是一種含有許多共軛雙鍵的異戊二烯類聚合物[4]，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，在儲(chǔ)存和加工過程中易被氧、高溫以及光輻射等因素作用而發(fā)生降解和失活，導(dǎo)致其生物利用程度低，在食品加工方面的應(yīng)用受到極大的限制[5]。因此，采用納米化包埋對葉黃素進(jìn)行物理改性，對于提高其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、促進(jìn)機(jī)體吸收進(jìn)而充分發(fā)揮其生物活性具有重要意義。

近年來，玉米醇溶蛋白(Zein)作為一種天然高分子材料在食品活性成分載體方面的應(yīng)用引起了人們廣泛的關(guān)注。Wang等[6]通過玉米醇溶蛋白/殼聚糖膠體改善和調(diào)節(jié)乳劑的界面，用一種簡便的反溶劑方法制備了具有中性潤濕性的高電荷ZCCPs粒子。Huang等[7]采用抗溶劑沉淀和靜電沉積相結(jié)合的方法制備了白藜蘆醇-玉米醇溶蛋白/果膠納米粒，提高了白藜蘆醇的體外抗氧化能力和生物利用度。Dai等[8]采用抗溶劑沉淀技術(shù)制備玉米醇溶蛋白-卵磷脂納米粒，提高了姜黃素的耐熱、紫外輻照和高離子強(qiáng)度穩(wěn)定性。但是，玉米醇溶蛋白膠體顆粒尺寸較大，在水相中容易聚集，且對負(fù)載的脂溶性功能成分的控釋性能較差。這極大地限制了玉米醇溶蛋白在功能性載體領(lǐng)域中的應(yīng)用。目前有研究采用酶解法對玉米醇溶蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，改善其疏水性和溶解分散性，提高載運(yùn)性能。例如，Wang等[9]以玉米醇溶蛋白水解物作為負(fù)載姜黃素的載體，提高了姜黃素的水溶性和穩(wěn)定性。Lin等[10]成功開發(fā)玉米醇溶蛋白酶解物作為VD3的納米載體，有效提高了VD3的光化學(xué)穩(wěn)定性和生物利用率。

酶解改性可以改善玉米醇溶蛋白的功能特性，使其更適合作為功能性活性物質(zhì)的有效載體，但是如何通過有效的酶解方法對玉米醇溶蛋白進(jìn)行改性，進(jìn)而提高對脂溶性葉黃素的負(fù)載性能，最終改善其功能活性的研究還鮮見報(bào)道。本研究采用反應(yīng)溫和、酶解效率高的中性蛋白酶對玉米醇溶蛋白進(jìn)行改性，構(gòu)建酶解玉米醇溶蛋白負(fù)載葉黃素納米載運(yùn)體系，研究其包封性能和結(jié)構(gòu)表征，并考察其溶解性、抗氧化活性以及體外釋放特性。本研究對于改善葉黃素的結(jié)構(gòu)性質(zhì)及體內(nèi)吸收利用率，拓展玉米醇溶蛋白和葉黃素的應(yīng)用領(lǐng)域具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥90%)、玉米醇溶蛋白、DPPH、中性蛋白酶(酶活力：50 000 u/g)、無水乙醇、石油醚等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

H-7650透射電子顯微鏡，Nano-Zs90納米粒度和Zeta電位測定儀，RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，CJJ-931四聯(lián)磁力加熱攪拌器，TGL-16G離心機(jī)，BS-1E振蕩培養(yǎng)箱，UV-2450型紫外分光光度計(jì)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 葉黃素含量的測定

配制不同濃度梯度的葉黃素標(biāo)準(zhǔn)液，在445 nm處測定吸光值，制作葉黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：Y=0.005X+0.000 5，R2=0.999。由此可知在0～10 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，葉黃素標(biāo)準(zhǔn)液在445 nm波長處的含量與吸光值線性關(guān)系良好[11]。

1.3.2 玉米醇溶蛋白酶解

采用中性蛋白酶(NPT)對玉米醇溶蛋白進(jìn)行酶解：取一定量的玉米醇溶蛋白加入到去離子水中混勻，加入一定量的中性蛋白酶，調(diào)節(jié)pH，在40～60 ℃條件下酶解0～120 min。酶反應(yīng)后在95℃條件下蒸煮5 min滅酶。將得到的玉米醇溶蛋白酶解物凍干，4 ℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 玉米醇溶蛋白酶解物-葉黃素納米粒(CPH-LUT)的制備[12]

采用反溶劑法制備CPH-LUT。取5.0 mL葉黃素標(biāo)準(zhǔn)液(100 μg/mL)，加入5.0 mL CPH乙醇溶液(2.5 mg/mL)，使其充分混合均勻，在3 000 r/min下離心5 min，取上清液加入18.5 mL的PBS緩沖溶液，在一定溫度下攪拌水合30 min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，隨后定容到20 mL，得到CPH-LUT納米粒溶液。同時(shí)在相同條件下制備玉米醇溶蛋白負(fù)載葉黃素納米粒(Zein-LUT)。

1.3.4 包封率的測定[12,13]

取CPH-LUT納米懸浮液3.0 mL，加入3.0 mL石油醚漩渦混勻60 s，充分提取游離的葉黃素，在3 000 r/min條件下離心5 min，取上清液在445 nm處測其吸光值，計(jì)算游離的葉黃素的質(zhì)量濃度C1，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。包封率(EE)的計(jì)算公式為：

(1)

式中：C1為葉黃素的質(zhì)量濃度/μg/mL；V為加入CPH-LUT納米懸浮液的體積/mL；M為葉黃素的總量/μg。

1.3.5 CPH-LUT制備單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.5.1 酶解條件對CPH-LUT納米粒包封率的影響[14,15]

將一定量的玉米醇溶蛋白分散于去離子水中，分別添加1.80%、2.10%、2.40%、2.70%、3%(底物質(zhì)量按蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì))的NPT，將混合液pH分別調(diào)整為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，分別置于40、45、50、55、60 ℃下水解0、30、60、90、120 min，后于95 ℃下保持5 min，對酶進(jìn)行滅活，終止反應(yīng)。水解產(chǎn)物經(jīng)冷凍干燥48 h，按照1.3.3方法制備納米粒，測定不同酶解條件下對葉黃素的包封率。

1.3.5.2 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化CPH-LUT制備的最佳條件，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表

1.3.6 透射電子顯微鏡(TEM)觀測

將CPH-LUT納米粒溶液滴加到經(jīng)等離子體處理(輝光放電)的碳膜載網(wǎng)上，采用紅外燈烘干，置于透射電子顯微鏡下觀測CPH-LUT納米粒的微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.7 粒徑和Zeta電位的分析測定

參考Hu等[16]的方法，取1.0 mL CPH-LUT納米粒樣品置于Nano-90粒徑分析儀樣品池中進(jìn)行分析，測定CPH-LUT納米粒的平均粒徑、表面Zeta電位以及多分散系數(shù)。

1.3.8 抗氧化活性分析

1.3.8.1 DPPH法測定葉黃素及其納米粒的自由基清除活性

參考Guan等[17]的方法，取2.0 mL不同納米粒溶液(葉黃素質(zhì)量濃度為25 μg/mL)，加入2.0 mL 0.8 mg/mL DPPH溶液，充分振蕩后避光反應(yīng)30 min，517 nm處測定吸光值記為A1；樣品中僅加入乙醇作為空白組，記為A2；乙醇代替樣品為對照組，記為A0，DPPH自由基清除率計(jì)算公式為：

(2)

1.3.8.2 葉黃素及其納米粒對羥基自由基清除活性

參考蔡建秀等[18]的方法，取0.2 mL不同納米粒溶液(葉黃素質(zhì)量濃度為25 μg/mL)，加入1.0 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液，1 mL 6 mmol/L的水楊酸溶液混勻后靜置10 min，加入1.0 mL 6 mmol/L的H2O2溶液啟動(dòng)反應(yīng)，避光反應(yīng)30 min，510 nm處測定吸光值記為A1，以1.0 mL蒸餾水代替FeSO4溶液，記為A2，以0.2 mL蒸餾水代替納米懸浮液，記為A0，羥基自由基清除率計(jì)算公式為：

(3)

1.3.9 溶解分散性分析[19,20]

將葉黃素、Zein-LUT以及CPH-LUT納米懸浮液分別在5 000 r/min條件下離心10 min，上清液經(jīng)0.45 m膜過濾，除去不溶性葉黃素，取過濾后的溶液超聲振蕩5 min，將2.0 mL樣品與4.0 mL石油醚混合，漩渦振蕩60 s。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，取上清液于445 nm處測其吸光值，計(jì)算葉黃素溶液濃度C2。溶解度計(jì)算公式為：

(4)

式中：C2為葉黃素的質(zhì)量濃度/μg/mL；V1為石油醚體積/mL；V2為樣品體積/mL。

1.3.10 葉黃素納米粒的體外釋放特性

參考田少君等[21]方法配制人工胃液和腸液。取一定量的CPH-LUT納米懸浮液，按照1∶3的比例加入模擬胃液或腸液，攪拌均勻后置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中， 在37 ℃，120 r/min的條件下消化6.0 h。按時(shí)間梯度0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 h，準(zhǔn)確取3.0 mL樣品同時(shí)補(bǔ)充3.0 mL同溫度的模擬胃液或腸液，樣品與3.0 mL石油醚旋渦振蕩60 s，在4 000 r/min條件下離心5 min，收集上清液于445 nm處測其吸光值，計(jì)算釋放葉黃素的質(zhì)量濃度，代入公式計(jì)算累計(jì)釋放率(Qt)[22]：

(5)

式中：Ct為t時(shí)刻葉黃素的質(zhì)量濃度/μg/mL；Vt為t時(shí)刻中懸浮液媒介體積/mL；M為葉黃素的總質(zhì)量/μg。

采用4種常見的動(dòng)力學(xué)模型對CPH-LUT納米粒在人工胃液或腸液中的釋放曲線進(jìn)行擬合，求得符合葉黃素釋放的最佳模型，包括：

零級動(dòng)力學(xué)模型(Qt=kt)、一級動(dòng)力學(xué)模型(ln(1-Qt)=-kt)、Higuchi模型(Qt=kt1/2)、Ritger-Peppas 方程(Qt=ktn)。

式中：Qt為t時(shí)刻的累積釋放分?jǐn)?shù)；k為釋放速率常數(shù)；Ritger-Peppas模型中的n值表示釋放機(jī)制[23]。根據(jù)所得方程的相關(guān)系數(shù)R2, 判斷釋放方程擬合的最佳模型。

1.3.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和誤差分析，利用Origin2017進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合作圖，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 CPH-LUT納米粒制備單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 酶用量對CPH-LUT制備效果的影響

由圖1可知，隨著酶用量的增加，CPH對葉黃素的包封率增大，當(dāng)酶用量達(dá)到2.70%時(shí)，包封率最高達(dá)到90.13%。隨著酶用量的提高，酶分子與底物結(jié)合的幾率增大[24]，玉米醇溶蛋白的一級結(jié)構(gòu)被破壞，逐漸水解產(chǎn)生CPH，酶解后獲得的CPH中具有大量的兩親性多肽片段，與葉黃素結(jié)合充分，使得葉黃素的包封率提高，當(dāng)酶用量超過2.7%時(shí)，酶分子已經(jīng)結(jié)合了底物絕大部分作用位點(diǎn)，葉黃素的包封率不再升高。故酶用量為2.7%時(shí)，CPH-LUT制備的效果最佳。

圖1 不同酶解條件對LUT包封率的影響

2.1.2 酶解時(shí)間對CPH-LUT制備效果的影響

未酶解的玉米醇溶蛋白對葉黃素的包封率較低，酶解得到的CPH對葉黃素的包封率隨著酶解時(shí)間的增加而增大，酶解60 min時(shí)，葉黃素的包封效果最好，包封率達(dá)到91.43%。酶解時(shí)間的繼續(xù)增加，包封率趨于平穩(wěn)甚至略有下降。這是因?yàn)殡S著酶解時(shí)間的進(jìn)行，CPH的量逐漸增加，與葉黃素結(jié)合能力增強(qiáng)，使得包封率提高。隨著酶解時(shí)間的延長，酶與蛋白的結(jié)合位點(diǎn)減少，且NPT的活性逐漸降低[25]，酶解效率降低。與此同時(shí)產(chǎn)生了一部分小分子肽及氨基酸，所以包封率變化略微下降，故60 min為最佳酶解時(shí)間。

2.1.3 酶解溫度對CPH-LUT制備效果的影響

隨著酶解溫度的上升，酶解得到的CPH對于LUT的包封效果在40～45 ℃呈現(xiàn)上升的趨勢，45 ℃時(shí)包封率最高達(dá)到91.33%。此時(shí)達(dá)到了NPT的最適溫度，酶分子的活力增強(qiáng)，與底物分子結(jié)合率增大，蛋白適度酶解，對葉黃素包封率提高。隨著溫度的不斷上升，酶活性下降[25]，蛋白也會(huì)發(fā)生變性且開始聚集，從而使得包裹葉黃素的效果呈下降趨勢。

2.1.4 酶解pH對CPH-LUT制備效果的影響

隨著pH值的增加，酶解得到的CPH對葉黃素的包封率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當(dāng)pH為7.0時(shí)，納米粒包封率最大，為91.04%，當(dāng)pH大于7.0時(shí)，包封率開始下降。這是因?yàn)橹行缘鞍酌?NPT)的活性在pH為7.0時(shí)最佳，此時(shí)有助于與底物玉米醇溶蛋白的活性位點(diǎn)結(jié)合，酶解效果增強(qiáng)。然而隨著pH值的持續(xù)升高，強(qiáng)堿環(huán)境會(huì)影響玉米醇溶蛋白的空間構(gòu)象，同時(shí)使得NPT活性降低，從而導(dǎo)致對葉黃素包封率降低。因此pH為7.0時(shí)酶解效果最佳。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

由表2和表3綜合分析可知，不同酶解條件下CPH對葉黃素包封率的影響大小依次為：A(酶用量)>C(酶解溫度)>B(酶解時(shí)間)>D(酶解pH)，最佳組合為A2B2C3D1。酶用量2.7%，酶解時(shí)間60 min，酶解溫度50℃，酶解pH 6.0，該組為最佳實(shí)驗(yàn)組，包封率為92.1 %。根據(jù)K值最優(yōu)組合為A2B2C2D3，進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到此條件下納米粒平均包封率為(91.6±0.62)%，小于組合A2B2C3D1的包封率。由此確定當(dāng)酶用量2.7%，酶解時(shí)間60 min，酶解溫度50 ℃，酶解pH 6.0條件下，CPH對葉黃素的包封效果最好。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)F值

2.3 透射電子顯微鏡(TEM)結(jié)果與分析

CPH-LUT納米粒在100、200、500 nm處TEM圖如圖2所示，CPH-LUT納米粒表面光滑，外觀呈現(xiàn)球形結(jié)構(gòu)，粒徑分布勻稱，在水中的分散性較好， LUT能夠與CPH載體結(jié)合形成納米微粒結(jié)構(gòu)，對其結(jié)構(gòu)和生物活性起到有效的保護(hù)作用。此外，CPH-LUT的粒徑在200 nm范圍，與Nano粒徑分析儀測定結(jié)果一致[26]。

圖2 CPH-LUT的透射電鏡圖

2.4 CPH-LUT粒徑及Zeta電位結(jié)果分析

CPH-LUT納米粒的粒徑和電位分布分別如表4、圖3和圖4所示。由表4和圖3可知，納米粒顆粒度范圍在95.07～356.2 nm，平均粒徑為173.7 nm，多分散系數(shù)為0.077。由圖4可知，CPH-LUT納米粒的Zeta電位為-18.1 mV，分布范圍較窄，粒子間靜電排斥作用較強(qiáng)，分散效果較好。表明CPH-LUT納米粒分散性良好，規(guī)整度較高，粒徑分布均勻穩(wěn)定，有助于生物活性的發(fā)揮。

表4 CPH-LUT粒徑百分比

圖3 CPH-LUT粒徑分布圖

圖4 CPH-LUT電位分布圖

2.5 不同納米粒的抗氧化能力比較分析

如圖5所示，游離葉黃素的抗氧化活性均較低，CPH-LUT納米粒的抗氧化活性高于Zein-LUT納米粒以及游離葉黃素。這是由于葉黃素自身性質(zhì)不穩(wěn)定，在制備納米粒過程中發(fā)生損失或失活，所以游離的葉黃素抗氧化活性較低。隨后當(dāng)?shù)攘康娜~黃素與玉米醇溶蛋白或CPH結(jié)合之后，其抗氧化能力均有所提高，這可能有兩方面原因：一是玉米醇溶蛋白或CPH包埋葉黃素后，降低了外界環(huán)境對于葉黃素的影響，使得其抗氧化能力增強(qiáng)；二是玉米醇溶蛋白或CPH自身具有一定的抗氧化能力，能夠?qū)θ~黃素提供一定的保護(hù)能力[27]。CPH本身具有更高的抗氧化能力，所以CPH-LUT的抗氧化能力最高。

圖5 不同納米粒的抗氧化能力比較

2.6 溶解分散性分析結(jié)果

由圖6表明，當(dāng)在相同濃度下，CPH-LUT納米粒的溶解度最高，高于Zein-LUT納米粒溶解度，是LUT溶解度的3倍。這可能是因?yàn)樵诓捎梅慈軇┓ㄖ苽浼{米粒的過程中，LUT與玉米醇溶蛋白或CPH通過氫鍵等非共價(jià)作用產(chǎn)生結(jié)合后形成分布均勻的納米顆粒，從而抑制了LUT的進(jìn)一步聚集與沉淀[27]。同時(shí)，酶解后的CPH因分子量較小且疏水性降低，導(dǎo)致水溶性增強(qiáng)，因此葉黃素與CPH形成的復(fù)合納米粒在水中的溶解度明顯高于Zein-LUT和游離葉黃素。

圖6 不同納米粒溶解度差異

2.7 CPH-LUT納米粒的釋放特性

由圖7所示，CPH-LUT納米粒在胃液中釋放率較低，而在腸液中CPH-LUT納米粒的釋放明顯高于在胃液中的釋放，在5 h時(shí)，釋放率最大可達(dá)到40.8%，隨后由于葉黃素存在一定的降解作用，葉黃素釋放率逐漸降低。說明CPH對包埋的葉黃素具有一定的緩釋作用。

圖7 CPH-LUT納米粒在模擬胃液和模擬腸液中的釋放

以零級釋放方程、一級釋放方程、Higuchi平面擴(kuò)散以及Retger-peppas方程分別對于CPH-LUT納米粒在胃液和腸液6 h內(nèi)釋放曲線進(jìn)行線性擬合。結(jié)果如表5和表6所示， CPH-LUT納米粒在胃液以及腸液中的釋放曲線，對應(yīng)的一級釋放方程明顯優(yōu)于其他模型，說明CPH-LUT納米粒在胃、腸液中的釋放均符合一級動(dòng)力學(xué)模型，屬于恒比釋放。而在Retger-peppas模型中，胃腸液釋放存在一定的差異，CPH-LUT納米粒在胃液中的釋放因子n=0.423 2<0.45，說明CPH-LUT納米粒在胃液6 h

表5 CPH-LUT納米粒在胃液中釋放曲線動(dòng)力學(xué)方程擬合結(jié)果

表6 CPH-LUT納米粒在腸液中釋放曲線動(dòng)力學(xué)方程擬合結(jié)果

的釋放是以Ficks擴(kuò)散為主。而CPH-LUT納米粒在腸液中的釋放因子0.45

3 結(jié)論

對玉米醇溶蛋白進(jìn)行酶解改性，結(jié)合反溶劑法構(gòu)建了玉米醇溶蛋白酶解物負(fù)載葉黃素納米體系。確定玉米醇溶蛋白最佳的酶解條件為：酶用量2.7%，酶解時(shí)間60 min，酶解溫度50 ℃，酶解pH 6.0，在此條件下對葉黃素的包封率最高可達(dá)到92.1%；該納米粒的平均粒徑為173.7 nm，多分散系數(shù)為0.077，Zeta電位為-18.1 mV，透射電鏡證實(shí)了該納米粒具有良好的微觀結(jié)構(gòu)，且顯示出良好的分散性和規(guī)整度；經(jīng)酶解后的玉米醇溶蛋白對葉黃素的溶解性和抗氧化活性具有明顯的改善作用；體外釋放動(dòng)力學(xué)研究表明，玉米醇溶蛋白酶解物對于葉黃素的釋放具有一定的緩釋作用，且釋放效果良好，在胃液中的釋放屬于Ficks擴(kuò)散，在腸液中的釋放是在擴(kuò)散以及納米顆粒溶蝕二者共同作用下進(jìn)行的，皆符合一級動(dòng)力學(xué)模型。