水酶法提取山蒼子核仁油工藝的研究

賴鵬英 黎繼烈 肖志紅 唐 娟 張愛華,

(中南林業科技大學1，長沙 410004)(湖南省林業科學院2，長沙 410004)

山蒼子Litseacubeba(Lour) Pers又名山雞椒、木姜子，是樟科木姜子屬落葉小喬木，主要分布在我國湖南、廣西、福建等地，是一種重要木本油料植物[1]。山蒼子果實應用價值高，常被用來提取山蒼子精油。在提取山蒼子精油過程中會產生大量的核仁殘留物，全國每年約有20萬t山蒼子核仁殘留物被直接被丟棄，造成資源的巨大浪費[2, 3]。山蒼子核仁來源豐富，油脂含量高達40%，其脂肪酸成分與椰子油相似，在一定程度上可替代椰子油，具有較高經濟價值，但由于缺乏技術的指導和資金投入，一直沒有得到良好開發[4]。

工業提取植物油一般采用溶劑萃取法，若需考慮無化學污染的提取方法則選擇物理壓榨法[5]。壓榨法通過機械擠壓油料提取油脂，是最常用的方法，但存在出油率低、出油速度慢等缺點。溶劑萃取法是利用油脂可溶于有機溶劑的特性萃取油脂，出油率較高，但需要脫溶劑過程[6]。超臨界CO2萃取能顯著提高出油率，但技術和設備要求較高，不易放大生產[7]。隨著我國對環境保護的重視及人民健康意識的提升，水酶法提取油脂因其安全性佳、設備簡單、條件溫和、能耗低、效率高的顯著優勢被業界廣泛認可[8]。前期研究證明水酶法在提取無患子籽仁油[9]、牡丹籽油[10]、紅樹莓籽油[11]、大豆油[12]、葵花籽油[13]、蓖麻籽油[14]、櫻桃種子油[15]上均有良好效果，然而利用水酶法提取山蒼子核仁油鮮有報道。本研究以山蒼子核仁為原料,探究不同實驗條件復合酶對山蒼子核仁油提取率的影響，并對水酶法提山蒼子核仁油工藝條件進行優化，以期為該工藝的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山蒼子核仁、纖維素酶、果膠酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶；氫氧化鈉、鹽酸為分析純；乙腈、丙酮為色譜純。

1.2 儀器與設備

SY-2230恒溫水浴搖床，FA1204B電子分析天平，AZC-02多功能粉碎機，DF-101s集熱式恒溫磁力攪拌器，TDL5M臺式低速離心機，SZF-06A粗脂肪測定儀，FE20實驗室pH計，IS5型傅里葉紅外光譜儀，Scion-SQ型單四級桿氣質聯用儀。

1.3 方法

1.3.1 水酶法提取山蒼子核仁油

將150 ℃烘烤3 h后的山蒼子核仁用多功能粉碎機粉碎90 s，準確稱重20 g后調制合適液料比(水與山蒼子核仁體積質量比，下同)，待溫度上升至實驗設計溫度時用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH調節pH，加入一定比例的酶(以山蒼子核仁質量計，下同)，反應結束后100 ℃水浴滅酶10 min，將酶解產物冷卻至室溫，置于離心機中5 000 r/min離心20 min，離心結束取上層清油，計算提取率。

(1)

1.3.2 山蒼子核仁含油率的測定方法

山蒼子核仁含油率的測定方法參考GB/T 14488.1—2008《植物油料含油量測定》。

1.3.3 復合酶制劑篩選實驗

研究以酶的種類(纖維素酶、果膠酶、α淀粉酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶)、酶的復配(1∶1、2∶1、3∶1、1∶2、1∶3) 、酶的用量(1%、2%、3%、4%、5%)為影響因素進行復合酶制劑篩選實驗，先篩選出2種效果最佳的酶，再固定其復配及用量。

1.3.4 單因素實驗

研究分別以酶解pH(3、4、5、6、7)、液料比(1、3、5、7、9 mL/g)、酶解溫度(35、40、45、50、55 ℃)、酶解時間 (1、3、5、7、9 h)為影響因素進行單因素實驗，研究各因素對山蒼子核仁油提取率的影響。

1.3.5 響應面優化

采用Box-Behnken中心組合實驗設計方案，在單因素實驗基礎上，選取對酶解反應影響較大的3個因素進行響應面設計，建立山蒼子核仁油提取率的回歸方程，優化山蒼子核仁油提取工藝參數。

1.3.6 山蒼子核仁油的傅里葉紅外分析

利用傅里葉紅外(FT-IR)檢測水酶法最佳工藝條件下提取的山蒼子核仁油的化學結構、官能團組成。

FT-IR檢測條件[16]：檢測器為中紅外DTGS檢測器，分辨率為4.0 cm-1，采集空氣為背景，采集次數設為16次，波數掃描范圍為400.0～4 000.0 cm-1。

1.3.7 山蒼子核仁油的脂肪酸成分分析

采用氣象色譜/質譜聯用儀(GC-MS)測定山蒼子核仁油的脂肪酸組成成分。

樣品預處理：對樣品進行甲酯化處理，參考GB 5009.168—2016方法。山蒼子核仁油GC-MS檢測條件[17]：色譜柱為HP-5彈性石英毛細管柱30 mm×0.25 mm×0.25 μm，載氣為He，流量2.0 mL/min；正己烷為溶劑；進樣口溫度280 ℃，分流比10∶1；傳輸線溫度280 ℃，EI離子源，電離電壓70 eV，電子倍增電壓980 V，溶劑延遲10 min，離子源溫度250 ℃，質荷比范圍50～550，5次/s全掃描。

2 結果及分析

2.1 復合酶制劑篩選實驗

2.1.1 酶種類的初步篩選

在料液比為2 mL/g，酶解反應時間7 h，加酶量4%條件下，考察纖維素酶(50 ℃，pH4.8)、果膠酶(50 ℃，pH3.0) 、α-淀粉酶(60 ℃，pH6.0) 、中性蛋白酶(40 ℃，pH7.0) 、堿性蛋白(50 ℃，pH8.0)對山蒼子核仁油提取率的影響。由圖1可知，每種酶在適當條件下都能促進核仁油的提取，而蛋白酶對山蒼子核仁油提取有明顯作用，如中性蛋白酶可使核仁油提取率提高20%左右，其次為纖維素酶。這可能是因為纖維素酶能降解、軟化細胞壁，而蛋白酶可以降解細胞中的蛋白，增加油脂流動性，使油脂更容易從細胞中游離出來[18]。綜合考慮，選擇中性蛋白酶與纖維素酶的復配。

注：1.纖維素酶；2.果膠酶；3.α-淀粉酶；4.中性蛋白酶；5.堿性蛋白酶；6.木瓜蛋白酶；7.對照。圖1 單一酶對山蒼子核仁油提取率的影響

2.1.2 酶的復配對提取率的影響

由圖2可知在料液比2 mL/g，酶解反應時間7 h，加酶量4%，pH6.0，酶解溫度45 ℃的條件下，中性蛋白酶與纖維素酶質量比1∶1核仁油的提取率最高，表明該質量配比的復合酶能夠有效地降解山蒼子核仁的細胞壁，從而使包埋在細胞內的油脂最大程度地被釋放到水中[19]。因此，復合酶選擇質量比1∶1。

圖2 中性蛋白酶與纖維素酶的質量比對提取率的影響

2.1.3 復合酶的用量對提取率的影響

在料液比為2 mL/g，酶解反應時間7 h，pH6.0，溫度45 ℃條件下，復合酶對核仁油提取率的影響如圖3所示。復合酶添加量未達3%以前，核仁油提取率隨復合酶用量的增加而上升；當復合酶添加量達到3%以后，核仁油提取率達到最大并基本保持穩定。為節約實驗成本，后續實驗復合酶的添加量固定為3%。

圖3 復合酶添加量對提取率的影響

2.2 單因素實驗

在蛋白酶與纖維素酶質量比1∶1，復合酶用量3%條件下，酶解pH、液料比、酶解溫度、酶解時間對山蒼子核仁油提取率的影響如圖4所示。

圖4 單因素對山蒼子核仁油提取率的影響

2.2.1 酶解pH對提取率的影響

在液料比2 mL/g，酶解反應時間7 h，溫度45 ℃條件下，酶解pH對提取率的影響如圖4所示。從圖4可以看出在山蒼子核仁油的提取率在pH3～pH6之間逐步增加，在pH6時提取率達到最高值，pH6以后提取率下降。這可能是因為復合酶存在最適pH，當時pH過高或過低時會引起復合酶酶活性降低，從而影響核仁油提取率。

2.2.2 液料比對提取率的影響

溫度45 ℃， pH6.0，酶解反應時間7 h考察液料比對核仁油提取率的影響，結果見圖4。液料比在3 mL/g時，核仁油提取率達到最大，繼續增大液料比，核仁油提取率下降。這是因為液料比小時漿液黏度大，油脂不易分離；而液料比太大會造成酶與底物的濃度下降，影響酶的效率[20]。

2.2.3 酶解溫度對提取率的影響

酶解反應pH6.0，料液比3 mL/g，酶解反應時間7 h，酶解溫度對提取率的影響如圖4所示。當溫度在35～45 ℃時，山蒼子核仁油的提取率隨著溫度的升高而增大；當溫度上升到45 ℃時，核仁油提取率達到最高值(84.27±0.7)%；繼續升高溫度，復合酶的活力受到影響，核仁油提取率下降。

2.2.4 酶解時間對提取率的影響

考察酶解反應pH6.0，溫度45 ℃，料液比為3 mL/g條件下，酶解時間對提取率的影響，結果如圖4所示。隨著酶解時間的增加山蒼子核仁油的提取率逐步上升，當酶解時間達到7 h，提取率達到最大值，繼續延長酶解時間，核仁油的提取率不再上升并基本保持穩定。酶解7 h后，酶解反應基本結束，繼續延長反應時間蛋白質及油脂可能會在水浴振蕩中乳化，因此綜合考慮，后續實驗固定酶解反應時間7 h。

2.3 響應面優化水酶法提油工藝

2.3.1 響應面實驗設計與結果

在單因素實驗的基礎上，選取對酶解反應影響較大的3個因素酶解溫度 (A) 、酶解pH (B) 、液料比 (C) 進行3因素3水平的響應面分析，對工藝參數進行優化。設計因素與水平編碼表如表1，響應面實驗設計及結果如表2所示。

表1 Box-Behnken實驗因素水平

表2 響應面實驗設計及結果

2.3.2 響應面優化分析

運用Design Expert8.0.6軟件對實驗數據進行分析處理，得到方差結果，如表3所示。

表3 響應面回歸模型方差分析

Y(核仁油提取率)=86.19+1.11A+1.11B-0.48C-0.55AB+2.30AC+2.32BC-3.43A2-2.86B2-3.21C2

模型方程式中各因素對應項系數的絕對值是該因素對核仁油提取率的影響程度，由此可知影響程度：酶解pH(B)，酶解溫度 (A)>液料比 (C)。

由表3可知，A、B、A2、B2、C2對響應值山蒼子核仁油提取率的影響高度顯著 (P<0.01) ，C不顯著的原因可能是響應面考察液料比這個變量的范圍較小。失擬項P>0.05，表明模型的失擬度不顯著，回歸系數R2為0.978 1，RPred2為0.835 6表明預測值與實驗值具有良好的擬合性，校正后的復測相關系數Radj2為0.949 8，測試值與校正值較為接近，表明該模型擬程度良好[21]。

2.3.3 各因素交互作用

酶解pH(B)與液料比(C)，酶解溫度(A)與液料比(C)的交互作用較強，酶解溫度(A)與酶解pH(B)無交互作用。

2.3.4 回歸模型的驗證

根據二次回歸方程的數學模型分析，得到的最佳提油工藝條件：液料比為3.11 mL/g、pH6.40、溫度45.83 ℃，模型預測在此條件下山蒼子核仁油的提取率能達到86.38%。為了便于實驗實際操作，后期驗證模型可靠性時將最佳工藝修正為液料比為3 mL/g、pH為6.40、溫度46 ℃。在修正后的工藝條件下重復3次實驗，得到山蒼子核仁油提取率為 (86.10±0.68)%，與理論預測值相近，表明響應面所建模型有效。

2.4 山蒼子核仁油的傅里葉紅外分析

對水酶法最佳工藝條件下提取的山蒼子核仁油進行FT-IR檢測，每一個峰和肩峰在一定程度上代表分子結構和官能團或脂質組分信息，結果如圖5所示。

2.5 山蒼子核仁油的脂肪酸成分分析

GC-MS分析水酶法最佳工藝條件下提取的山蒼子核仁油的脂肪酸組成，GC-MS圖譜如圖6所示，共鑒定出11種脂肪酸，相應的脂肪酸組成及含量見表4。

圖6 山蒼子核仁油總離子流色譜圖

表4 山蒼子核仁油的主要脂肪酸組成

11種脂肪酸中飽和脂肪酸5種，不飽和酸6種，與周軍[24]石油醚萃取的山蒼子核仁油脂肪酸組成一致。水酶法提取的山蒼子核仁油除不飽和脂肪酸的質量分數30.73%高于李湘洲等[25]有機溶劑萃取的山蒼子核仁油25.70%外，月桂酸含量51.92%，碳數居于10～12之間的中碳鏈脂肪酸等脂肪酸組成成分均無顯著性差異。

3 結論

水酶法提山蒼子核仁油的提取設備簡單，提取效率高，對環境影響小。本研究以山蒼子核仁為原料優化水酶法提油工藝，結果表明，水酶法提山蒼子核仁油的最佳工藝條件為中性蛋白酶與纖維素酶質量比1∶1，復合酶添加量為3%，酶解時間7 h，液料比3 mL/g，pH6.40，溫度46 ℃，在此條件下山蒼子核仁油提取率可達 (86.10±0.68)%，與預測值86.38%接近。

對最佳工藝條件下提取的山蒼子核仁油進行FT-IR及GC-MS分析發現：山蒼子核仁油在FT-IR檢測出的結構都能在GC-MS中找到對應的脂肪酸。GC-MS分析脂肪酸成分發現月桂酸質量分數為51.92%，不飽和脂肪酸為30.73%，碳數居于10～12之間的中碳鏈脂肪酸占68.8%，不同提油工藝提取的山蒼子核仁油油脂脂肪酸成分沒有明顯差異，化學成分分析表明山蒼子核仁油是一種具有開發潛力的天然油脂資源。