雞腿菇醋釀制過程中降糖因子及降血糖功效的變化

王毛毛，文 明，王雪婷，王如福

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030801）

雞腿菇（Coprinus comatus）學(xué)名毛頭鬼傘，其肉質(zhì)細(xì)膩可口，營養(yǎng)豐富，具有低脂、低糖、高蛋白的特性。雞腿菇還屬藥食同源類食用菌，具有抗氧化、降血糖、降血脂、提高免疫力等功效[1-2]。利用雞腿菇的營養(yǎng)功能進(jìn)行產(chǎn)品開發(fā)，提供消費者歡迎的雞腿菇系列功能性產(chǎn)品，有重要的實踐意義。

目前，國內(nèi)外對于雞腿菇的研究主要集中在栽培方式[3-4]、多糖的液態(tài)發(fā)酵工藝[5-6]以及多糖的分離純化[7-8]等方面。為了滿足人們對健康營養(yǎng)的飲食要求，科研人員對雞腿菇深加工產(chǎn)品進(jìn)行了研究，如王林山[9]利用乳桿菌和鏈球菌對雞腿菇進(jìn)行發(fā)酵制成雞腿菇酸奶；邵偉等[10]以馬鈴薯為主要原料，經(jīng)過雞腿菇發(fā)酵、酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵等多步生產(chǎn)出雞腿菇醋；蘭蓉等[11]以雞腿菇為主要原料，采用發(fā)酵法生產(chǎn)雞腿菇酒。上述研究都僅對工藝進(jìn)行探討，但對產(chǎn)品的功效鮮有報道。

本研究以雞腿菇鮮品為主要原料，基于山西老陳醋基本工藝釀制雞腿菇醋，對雞腿菇醋釀制過程中多糖、總黃酮和總酚的動態(tài)變化進(jìn)行研究，通過測定各階段樣品對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率進(jìn)行體外降血糖能力的評價，揭示雞腿菇醋發(fā)酵過程中功效成分及其體外降血糖功效的動態(tài)變化，為改進(jìn)釀制工藝、提高醋品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞腿菇：山西晉中市太谷縣；高粱、大曲和谷糠：山西省晉中市榆次區(qū)某醋廠；麩皮、稻殼：安徽省壽縣；安琪釀酒高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）、福林酚試劑（分析純）：北京索萊寶生物科技有限公司；α-葡萄糖苷酶（酶活100 U/g）、α-淀粉酶（酶活3 700 U/g）和4-對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）：上海伊卡生物技術(shù)有限公司；NaCl（分析純）、可溶性淀粉、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）、沒食子酸（分析純）、無水碳酸鈉（分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylicacid，DNS）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SpectraMax i3x酶標(biāo)儀：美谷分子儀器（上海）有限公司；722可見光分光光度計、FA224電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；Starter 2C pH計：奧豪斯儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 雞腿菇醋加工工藝流程

1.3.2 操作要點

雞腿菇漿的制備：挑選品質(zhì)良好的新鮮雞腿菇，清洗干凈并切片，放入打漿機中打漿，加入纖維素酶（酶用量為2 800 U/g）和蛋白酶（酶用量為3 200 U/g）進(jìn)行酶解處理得到雞腿菇漿。

高粱潤料：稱取高粱和雞腿菇，兩者質(zhì)量比為7∶3。將高粱浸于水（高粱質(zhì)量的60%）中12 h，使得高粱充分吸水，利于后期蒸煮糊化。

高粱糊化、液化：潤料結(jié)束后加入高粱質(zhì)量的3.4倍水開始升溫糊化，升溫至60 ℃時加入耐高溫α-淀粉酶（用量為900 U/g），目的是水解高粱中淀粉內(nèi)部的α-1,4葡萄糖苷鍵，使得膠狀高粱淀粉溶液的黏度迅速下降，產(chǎn)生糊精。繼續(xù)升溫至沸騰10 min后停止加熱。

高粱糖化：待溫度降至60 ℃時加入糖化酶（酶用量為3 200 U/g），它能水解α-1,4葡萄糖苷鍵產(chǎn)生葡萄糖，也能緩慢水解α-1,6葡萄糖苷鍵，轉(zhuǎn)化為葡萄糖，同時也能水解糊精釋放葡萄糖。溫度降至30 ℃時加入大曲，用量為高粱質(zhì)量的62.5%。

酒化發(fā)酵：將酵母菌接入高粱糖化醪中，接種量為5%，前3 d敞口發(fā)酵，早晚各攪拌一次，3 d后加入雞腿菇漿混合均勻封口進(jìn)行無氧發(fā)酵，每天測定酒精度，酒化時間約8～9 d酒精度升至7%vol～9%vol且不再升高時酒化結(jié)束。

拌輔料：稱取90%麩皮，46.8%谷糠，23.3%稻殼（以高粱質(zhì)量為準(zhǔn)）且混合均勻，多次少量地拌入酒醪中。

醋化發(fā)酵：待醋醅酸度約為5 g/100 mL且不再升高時醋化結(jié)束。

熏醅：將60%的醋醅在90 ℃條件下進(jìn)行熏醅5 d，此時醋醅在高溫作用下發(fā)生美拉德反應(yīng)，產(chǎn)生大量的香味物質(zhì)，其余的白醅壓實表面撒食鹽，保證其不發(fā)生變質(zhì)。

淋醋：先用高粱質(zhì)量8倍的熱水淋白醅，得到白醋。白醋浸泡熏醅5 h淋出雞腿菇醋。

澄清：采用硅藻土-殼聚糖（1∶1）復(fù)合澄清劑，添加量為0.7 g/100 mL，澄清溫度為38 ℃，澄清時間為35 min。

滅菌、灌裝：于121 ℃滅菌15min，無菌灌裝于玻璃瓶中，得到雞腿菇醋。

1.3.3 取樣

將酵母菌接入高粱糖化醪時計作樣品J0；酒化發(fā)酵時間為9 d，隔天取樣，計作樣品J1～J9；將輔料拌入酒化醪時計作樣品C0；醋化發(fā)酵時間為9 d，隔天取樣，計作樣品C1～C9；熏醅時間為5 d，隔天取樣，計作X1～X5；浸淋得到的雞腿菇醋計作樣品C。

1.3.4 分析檢測

（1）理化指標(biāo)

酒精度：比重計法；還原糖、總酸、總酯、氨基酸態(tài)氮、不揮發(fā)酸、總黃酮：參照GB/T 19777—2003《地理標(biāo)志產(chǎn)品山西老陳醋》[12]測定。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.246 3x+0.003 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 4。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算樣品中總黃酮含量。

（2）多糖含量

多糖含量測定采用苯酚-硫酸法[13]。取10 mg樣品，加100 mL水，85 ℃提取3次，每次5 h。過濾合并濾液濃縮至40 mL，加入4倍體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇醇沉過夜。離心過濾取沉淀，依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，于55 ℃條件下真空干燥，得粗多糖，將其加水溶解至100 mL，用苯酚-硫酸法進(jìn)行測定多糖含量。

（3）總酚含量

總酚含量測定采用Folin-Ciocalteau法[14]。以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為：y=0.035 8x+0.010 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 6。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算樣品中總酚含量。

（4）α-葡萄糖苷酶抑制率

參照饒炎炎等[15]的方法并加以改進(jìn)。先將不同階段的樣品進(jìn)行稀釋處理，稀釋倍數(shù)為20倍。用0.1 mol/L，pH 6.8磷酸鹽緩沖溶液配制α-葡萄糖苷酶溶液（1 U/mL）和PNPG溶液（10 mg/mL）。在37 ℃條件下孵育α-葡萄糖苷酶（50 μL）和樣品（100 μL）的混合物15 min使酶活化后，加入PNPG溶液50 μL，充分混勻后于37 ℃溫育10 min，加入0.1 mol/L的Na2CO3溶液100 μL終止反應(yīng)，于波長405 nm處測定吸光度值，同時設(shè)定相同體系下去離子水代替α-葡萄糖苷酶溶液為樣品對照組、去離子水代替樣品溶液為空白對照組，α-葡萄糖苷酶的抑制率計算公式如下：

（5）α-淀粉酶抑制率的測定

參照饒炎炎等[15]的方法并加以改進(jìn)。將不同階段的樣品稀釋20倍處理。用0.1 mol/L，pH 6.8磷酸鹽緩沖溶液配制α-淀粉酶溶液（1 U/mL）和1.0%的可溶性淀粉溶液。在37 ℃條件下孵育α-淀粉酶溶液（50 μL）和樣品（100 μL）的混合物15 min使酶活化后，加入可溶性淀粉溶液50 μL，充分混勻后于37 ℃溫育10 min，加入1 mol/L的DNS溶液5 μL顯色，沸水浴滅酶10 min后冷卻至室溫，定容至10 mL后于波長540 nm處測定吸光度值，樣品對照組、空白對照組和α-淀粉酶的抑制率按公式均與α-葡萄糖苷酶的測定一致。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019進(jìn)行錄入、計算實驗數(shù)據(jù)，采用Origin 8.0軟件作圖，SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞腿菇醋發(fā)酵過程中降糖因子的動態(tài)變化

2.1.1 多糖的變化

多糖廣泛存在于動物細(xì)胞膜、植物和微生物細(xì)胞壁，具有免疫調(diào)節(jié)和降血糖等功效[16]。對食醋品質(zhì)如滋味、香味和功效有重要作用[17]。雞腿菇醋發(fā)酵過程中多糖的變化結(jié)果見圖1。

圖1 雞腿菇醋發(fā)酵過程中多糖含量變化Fig.1 Change of polysaccharide contents in Coprinus comatus vinegar during fermentation process

由圖1可知，酒化發(fā)酵階段多糖含量呈不斷增加的趨勢，酒化1～3 d多糖含量增加顯著（P＜0.05），酒化結(jié)束時多糖含量為（6.77±0.038）mg/mL，多糖主要來源于雞腿菇、高粱和大曲等原料，酒化第3天加入酶解雞腿菇漿，雞腿菇漿多糖含量為6.23 g/100 g，所以此時多糖含量顯著上升（P＜0.05），酒化階段產(chǎn)生的大量乙醇將原料中的多糖物質(zhì)持續(xù)溶解出來[18]。在醋化階段，醋醅中多糖含量呈緩慢減少的趨勢，醋化結(jié)束時多糖含量為（4.257±0.025）mg/mL。這是由于多糖在酸性條件下不穩(wěn)定造成的。熏醅階段多糖含量稍有回升后趨于平穩(wěn)，原因在于高溫有助于多糖分子的向外擴散，多糖在高溫下進(jìn)一步從物料中溶出[19]。雞腿菇醋中多糖含量為（5.073±0.090）mg/mL，與剛加入雞腿菇的酒醪（J3）相比，雞腿菇醋多糖含量保留了94%。這表明多糖在雞腿菇醋釀制過程中有一定的損失，但損失量小。

2.1.2 總黃酮的變化

黃酮類物質(zhì)是一類重要的生物活性物質(zhì)，具有抗氧化、降血糖、抗菌抗炎等藥理作用[20]。雞腿菇醋發(fā)酵過程中總黃酮的變化結(jié)果見圖2。由圖2可知，在酒化發(fā)酵階段，總黃酮含量呈先增加后減少的趨勢，在酒化第3天，總黃酮含量最高為（244.51±3.927）mg/100 g。前3 d總黃酮增加的原因是存在于原料中的黃酮物質(zhì)在酒化發(fā)酵進(jìn)行中隨著碳源物質(zhì)的消耗被釋放出來[21]。大曲中的微生物生長代謝產(chǎn)生的代謝物也是使得黃酮增長的原因之一。酒化第4～9天黃酮含量呈減少趨勢，這與閆霞等[22]對山西陳醋抗氧化物質(zhì)含量分析基本一致。酒化前3 d處于發(fā)酵的旺盛期，原料中大部分黃酮類物質(zhì)已基本溶出，后期溶出率降低。黃酮類化合物可能有部分轉(zhuǎn)化為了其他酚類物質(zhì)，故總黃酮含量有所下降。醋化發(fā)酵前3 d總黃酮含量有一定的增長，后期趨于平穩(wěn)。醋化拌入的麩皮谷糠等輔料中含有黃酮類物質(zhì)[23]，醋酸菌的生長代謝促使黃酮的釋放，使得黃酮含量上升，黃酮類物質(zhì)得到有效積累。熏醅階段總黃酮含量呈上升趨勢，熏醅結(jié)束時其含量為（226.820±0.997）mg/100 g，醋中黃酮含量為（232.923±2.376）mg/100 g。可能是因為熏醅是加熱的過程，醋醅中水分會大量蒸發(fā)，總黃酮含量得到濃縮；加熱過程中微生物破裂溶解，胞內(nèi)物質(zhì)也會釋放黃酮類物質(zhì)[24]。總的看來，黃酮物質(zhì)在雞腿菇醋的釀制過程中得到有效積累。

圖2 雞腿菇醋發(fā)酵過程中總黃酮含量變化Fig.2 Change of total flavonoids contents in Coprinus comatus vinegar during fermentation process

2.1.3 總酚的變化

酚類物質(zhì)具有抗氧化和抗誘導(dǎo)有機體突變等作用，可賦予食醋醇厚、豐滿的口感，提高醋的抗氧化能力。雞腿菇醋發(fā)酵過程中總酚的變化結(jié)果見圖3。由圖3可知，酒化階段總酚含量呈逐漸上升的趨勢，酒化結(jié)束時總酚含量為（0.8±0.017）mg/mL，增量顯著（P＜0.05）。原因是在酒化過程中不斷產(chǎn)生的酒精和二氧化碳將原料中的酚類物質(zhì)大量釋放出來[25]。醋化階段總酚呈現(xiàn)先增加后降低并逐漸趨于平穩(wěn)的趨勢，在第3天達(dá)到最大值，總酚含量為（1.453±0.015）mg/mL。總酚含量在醋化發(fā)酵前3 d有所增加，其原因在于微生物等的生長代謝使得輔料中的酚類物質(zhì)得到釋放[26]，之后總酚含量降低并趨于平穩(wěn)的原因是有氧發(fā)酵過程中多酚發(fā)生氧化并且部分多酚與單寧物質(zhì)結(jié)合。熏醅階段總酚含量呈上升趨勢，熏醅結(jié)束時其含量為（1.757±0.012）mg/mL，雞腿菇醋總酚含量為（1.73±0.01）mg/mL。總酚含量在該階段有所增加的原因在于熏醅階段溫度升高，水分蒸發(fā)，總酚得到了濃縮。綜上所述，總酚含量在雞腿菇醋釀制過程中得到了積累。

圖3 雞腿菇醋發(fā)酵過程中總酚含量變化Fig.3 Change of total phenols contents in Coprinus comatus vinegar during fermentation process

2.2 雞腿菇醋發(fā)酵過程中α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率的的動態(tài)變化

雞腿菇醋發(fā)酵過程中α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率的變化結(jié)果見圖4。

圖4 雞腿菇醋發(fā)酵過程中α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率變化Fig.4 Change of inhibition rate of α-glucosidase and α-amylase in Coprinus comatus vinegar during fermentation process

由圖4可知，雞腿菇醋發(fā)酵過程中α-葡萄糖苷酶抑制率呈先上升后下降再上升的趨勢，α-淀粉酶抑制率呈先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢。高粱糖化醪（J0）的α-葡萄糖苷酶抑制率為（72.1±1.3）%。酒化發(fā)酵1～3 d，α-葡萄糖苷酶抑制率呈上升趨勢，由（82.2±1.2）%上升至（87.9±1.2）%，酒化第3～9天，α-葡萄糖苷酶抑制率逐步降低。α-淀粉酶抑制率在酒化階段呈上升趨勢，由（73.7±1.4）%上升至（74.6±0.6）%。醋化和熏醅階段，兩種酶抑制率均呈上升趨勢，這可能與雞腿菇醋發(fā)酵過程中功能成分的消長有相關(guān)性。最終形成的雞腿菇醋α-葡萄糖苷酶抑制率為（95.8±1.0）%；α-淀粉酶抑制率為（94.3±1.4）%。與高粱糖化醪（J0）和剛加入雞腿菇的酒醪（J3）相比，降血糖功效有一定的提升。

2.3 雞腿菇醋活性成分與降血糖功效的相關(guān)性分析

由表1可知，α-葡萄糖苷酶抑制率與總黃酮極顯著相關(guān)（P＜0.01），與總酚顯著相關(guān)（P＜0.05）。α-葡萄糖苷酶抑制率與多糖呈較低的相關(guān)性，可能是因為多糖和蛋白質(zhì)等功能成分都對α-葡萄糖苷酶有抑制性，同時抑制性有協(xié)同作用[27]。α-淀粉酶抑制率與總酚極顯著相關(guān)（P＜0.01），與多糖顯著相關(guān)（P＜0.05），總黃酮對α-淀粉酶抑制率的貢獻(xiàn)率最小。

表1 雞腿菇醋活性成分與降血糖功效的相關(guān)性Table 1 Correlation between the active components of Coprinus comatus vinegar and its hypoglycemic effect

2.4 理化指標(biāo)

對雞腿菇醋的各項理化指標(biāo)進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。由表2可知，雞腿菇的各項理化指標(biāo)均達(dá)到國標(biāo)GB 18187—2000《釀造食醋》[28]的要求。雞腿菇醋總酯含量為（3.752±0.032）g/100 mL，高于林汲等[29]測定的三種品牌老陳醋總酯含量。氨基酸態(tài)氮含量為（0.294±0.012）g/100 mL，說明雞腿菇的蛋白質(zhì)和氨基酸有效轉(zhuǎn)移入雞腿菇醋中，不但增加了雞腿菇醋的營養(yǎng)，而且起到了提鮮增香的效果。還原糖含量為（2.15±0.015）g/100 mL，糖類物質(zhì)與食醋的風(fēng)味和營養(yǎng)價值密切相關(guān)，為食醋增甜增鮮[30]。不揮發(fā)酸的含量為（1.426±0.011）g/100 mL，不揮發(fā)酸可較好地緩解揮發(fā)酸帶來的刺激性，使得食醋的酸味柔和、綿長，對食醋的風(fēng)味具有重要意義[31]。

表2 雞腿菇醋理化指標(biāo)測定結(jié)果Table 2 Determination results of physicochemical indexes of Coprinus comatus vinegar g/100 mL

3 結(jié)論

以雞腿菇鮮品為主要原料釀制雞腿菇醋，其各項理化指標(biāo)均達(dá)到GB 18187—2000《釀造食醋》的要求；雞腿菇醋釀制過程中多糖含量和總黃酮含量呈先上升后下降的趨勢，總酚呈逐漸上升的趨勢，α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率呈先上升后下降的趨勢，其中多糖在酒化結(jié)束時達(dá)到最大值，含量為（6.77±0.038）mg/mL；總黃酮在醋化第3天達(dá)到最大值，含量為（244.51±3.927）mg/100 g；總酚在熏醅結(jié)束時達(dá)到最大值，含量為（1.757±0.012）mg/mL。α-葡萄糖苷酶抑制率在雞腿菇醋中達(dá)到最大值為（95.8±1.0）%，α-淀粉酶抑制率在醋化結(jié)束時達(dá)到最大值為（86.4±1.1）%。雞腿菇醋中多糖、總黃酮、總酚含量分別為（5.073±0.090）mg/mL、（232.92±2.37）mg/100 g、（1.730±0.010）mg/mL，α-淀粉酶抑制率為（84.3±1.4）%。由此看來，以上三種功能成分較好地保留于雞腿菇醋中，與酶解后的雞腿菇漿相比降血糖功效有一定的提升。