煙草貯藏過程中包裝方式對TSNAs形成的影響

張夢玥，劉德水，王俊,3，趙園園，周駿，馬雁軍，魯喜梅，史宏志*

1 河南農業(yè)大學煙草學院/煙草農業(yè)減害研究中心，鄭州 450002；

2 上海煙草集團北京卷煙廠有限公司，北京 100024；

3 鄭州大學，鄭州 450002

煙草貯藏是煙葉加工利用的重要環(huán)節(jié)，調制后的煙葉必須經(jīng)過2年左右的貯藏和陳化才能被用于卷煙生產(chǎn)[1-3]。煙葉在貯藏過程中，多糖、色素、蛋白質、萜醇等大分子香氣前體物質在酶或非酶作用下進一步降解轉化，形成對香味品質有利的成分，雜氣和刺激性降低，余味改善，質量提升。但另一方面，在煙葉貯藏過程中一些有害成分也不斷形成和積累[4-5]。煙葉中的硝態(tài)氮可在貯藏溫度較高時產(chǎn)生揮發(fā)性的氮氧化物，并與生物堿發(fā)生亞硝化反應生成煙草特有亞硝胺（Tobacco-Specific Nitrosamines，TSNAs）。煙草特有亞硝胺是存在于煙草、煙草制品及煙氣中一類有害物質[6-8]，NNN和NNK對嚙齒動物具有強致癌性，可誘發(fā)小鼠、大鼠等的肺癌和腺癌，其中NNK導致肺癌的活性最強[9-12]。2007年，NNN和NNK被國際癌癥研究署（IARC）列為Ⅰ類致癌物[13]。據(jù)報道NNK可使動物和人體組織中的DNA出現(xiàn)甲基化，引發(fā)腫瘤的可能性增大[14-15]。迄今為止，已分離鑒定出的TSNAs共有8種[16]，目前研究較深入的主要有NNN、NAT、NNK和NAB，一般來說，TSNAs在煙葉成熟前和新鮮煙葉中含量極低，其形成和積累主要在煙草調制、貯藏和燃吸過程中[8-9,16-17]。TSNAs的直接前體物是生物堿和亞硝酸，煙葉生物堿的含量和組成及硝酸鹽含量與TSNAs的形成密切相關[18-20]。在煙葉調制過程中，葉面微生物可把煙葉中的硝態(tài)氮還原成亞硝酸，進而發(fā)生亞硝化反應[21-22]。調制中的煙葉暴露于微量的NOx即可生成TSNAs[23-24]；烤煙明火烘烤過程中，燃料燃燒能夠產(chǎn)生一定濃度的燃燒副產(chǎn)物NOx，明顯地促進煙葉烘烤過程中TSNAs的形成[25]。煙葉貯藏過程也是TSNAs形成的主要時期，Shi等研究得出，在自然貯藏條件下，白肋煙和曬煙中TSNAs含量在1年內顯著增加，兩種類型煙葉總TSNAs含量均增加了215%左右，上升最快的時期是高溫季節(jié)[26-28]。王俊等[28]通過使煙葉與硝酸鹽/亞硝酸鹽隔離共處后，測定樣品的TSNAs含量及周圍環(huán)境的NOx含量以及通過15N元素示蹤實驗得出了煙草在貯藏過程中TSNAs的生成途徑為NO3-N和NO2-N在高溫環(huán)境下產(chǎn)生氮氧化物（NOx），進而與生物堿反應形成TSNAs；煙葉生物堿亞硝化生成TSNAs的反應為氧化還原反應[29,25]，在貯藏袋中充入臭氧可大幅度提高TSNAs含量，綜上所述，去除貯藏環(huán)境中的氧化劑和氣態(tài)氮氧化物（NOx）有利于抑制TSNAs的形成[30-31]。

煙葉由葉片和煙梗兩部分組成，除葉片外，煙梗也是卷煙配方的主要原料之一，梗絲在卷煙配方中占比為8%～30%[32]。煙葉的葉片和煙梗在化學組成上差異很大，一般而言，葉片生物堿和香氣物質含量顯著高于葉梗，但煙梗的硝態(tài)氮含量顯著高于葉片[33-34]，在煙葉貯藏過程中煙梗TSNAs含量增加顯著，因此探究貯藏過程中煙葉和煙梗TSNAs的形成和抑制技術很有必要。雖然煙葉貯藏一般2～3年較為有利，但在實際生產(chǎn)中，由于庫存壓力等各種原因，煙葉實際貯藏時間可達5年以上，以往有關煙葉貯藏研究多基于短期貯藏試驗，關于抑制TSNAs形成的技術也局限于溫濕度的控制[35-37]。本研究以烤煙、白肋煙和雪茄煙葉為材料，探索了真空包裝等不同貯藏方式對降低煙葉葉片和煙梗貯藏過程中TSNAs形成的效果，旨在為優(yōu)質低害煙葉和卷煙生產(chǎn)提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗所用白肋煙品種為TN86（產(chǎn)自湖北省恩施市煙草公司）、烤煙品種為中煙100（產(chǎn)自河南省許昌市煙草公司）、雪茄茄芯煙葉品種為什煙1號（四川省德陽市煙草公司）以及雪茄茄衣品種為德雪3號（四川省德陽市煙草公司）。將樣品葉片和煙梗分離，葉片切成0.5 cm2大小的碎片，煙梗切成長0.5 cm左右混勻備用。置于4℃儲存待用。

1.2 試驗方法

1.2.1 包裝方式對常溫條件下煙葉TNSAs及中性致香成分含量的影響

稱取400 g的白肋煙樣品3份，分別采用塑料袋包裝、紙箱包裝、真空包裝袋抽真空處理后包裝，（真空時間17 s，充氣時間10 s，封口時間2 s，冷卻時間1.5 s，封口溫度中溫，真空度：0.085 Mpa）將3份樣品存放在實驗室的自然環(huán)境下貯藏一年，另一份樣品4℃低溫保存作為對照。處理結束后，測定煙葉TSNAs含量和中性香氣成分。

1.2.2 真空包裝對不同類型煙葉樣品葉片和煙梗TNSAs含量的影響

分別稱取50 g不同類型煙葉的葉片、煙梗（主脈）4份，取兩份樣品，其中一份采用真空包裝袋包裝并進行抽真空處理，另一份使用紙箱包裝作為常規(guī)包裝均放入恒溫恒濕箱內于45℃下處理15 d，其余兩份樣品，一份于常溫下使用紙箱包裝作為常規(guī)包裝處理15 d，另一份樣品4℃低溫保存作為貯藏前樣品對照，取出后分別進行冷凍干燥磨碎，磨碎后過250 μm篩，測定處理前后TNSAs變化，每個處理設置3次重復。

1.3 化學成分測定

1.3.1 TSNAs含量測定

樣品均由上海煙草集團北京卷煙廠進行測定。測定方法為在線SPE-液相色譜質譜聯(lián)用（SPE-LCMS/MS） 法（SPE-LC：Spark Holland，Symbiosis(Pico)；MS/MS：AB Sciex triple quad 5500）。稱取1.0 g煙樣，將其放入50 mL錐形瓶中，加入40 μL 4種氘代TSNAs（內標）溶液（5 000 ng/mL）和30 mL 100 mmol/L乙酸銨水溶液，在室溫下用振蕩器（200 r/min）萃取1小時，萃取液過0.45 μm水相濾膜后使用LC-MS/MS檢測TSNAs含量[19]。NNN、NNK、NAT和NAB含量之和即為TSNA總量。

1.3.2 中性致香成分測定

采用同時蒸餾萃取儀提取香氣物質，氣質聯(lián)用儀進 行 分 析（GC/MS：Agilent 7890A-5975C，Agilent Technologies，USA），內標法（硝基苯）進行測定。稱20.000 g煙樣放入100 mL圓底燒瓶中，依次加入2.0 g檸檬酸、0.5 mL內標和500 mL去離子水，充分搖勻。以40 mL的二氯甲烷為萃取劑，采用同時蒸餾萃取的方法收集有機相，并將樣品濃縮至1 mL左右，備用。樣品由GC/MS鑒定結果和NIST08庫檢索定性[38]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007進行基礎數(shù)據(jù)處理和繪圖、SPSS 20.0進行方差分析，分析不同包裝方式煙葉TSNAs、中性致香成分差異以及不同溫度、不同類型煙葉處理后葉片和煙梗TSNAs差異的顯著性。

2 結果與分析

2.1 包裝方式對常溫條件下煙葉TSNAs及中性致香成分含量的影響

2.1.1 包裝方式對常溫條件下煙葉TNSAs的影響

白肋煙煙葉采用不同包裝方式常溫條件下貯藏一年后，TSNAs含量的變化見圖1。與貯藏前相比，貯藏后樣品TSNAs的含量均有所增加，塑料袋包裝的樣品4種TSNA的含量與對照相比顯著增加（P＜0.05），TSNAs總量增加了128.72%，其中NNN和NNK含量分別增加了139.02%和119.85%；紙箱包裝的樣品TSNAs含量與塑料袋包裝的無顯著的差異（P＞0.05）。真空包裝處理的煙葉TSNAs增加幅度最小，TSNAs總量與對照相比提高了23.56%，NNN和NNK含量僅增加了17.67%和29.65%，差異不顯著（P＞0.05）；與紙箱包裝貯藏的煙葉相比，TSNAs總量降低了45.4%，NNN和NNK含量分別減少了46.3%和34.7%，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。研究結果表明，在常溫貯藏過程中，與塑料袋包裝、紙箱包裝相比，采用真空包裝處理能更好地抑制TSNAs的形成和積累。

圖1 包裝方式對白肋煙TSNAs形成的影響 (ng/g)Fig. 1 Effect of packaging method on TSNAs formation of burley tobacco

2.1.2 貯藏方式對常溫條件下煙葉中性香氣成分的影響

不同貯藏方式煙葉的中性香氣成分含量如表1所示，經(jīng)過一年的貯藏后，貯藏方式不同中性香氣物質含量差異較大，其中真空包裝處理的煙葉總香氣含量最高為632.9 μg/g，顯著高于其它處理（P＜0.05），塑料包裝的香氣物質總量次之，為563.77 μg/g，而紙箱包裝的煙葉香氣物質含量最低，為547.75 μg/g。貯藏方式不同，5類中性香氣物質的含量各不相同，其中真空包裝煙葉的類胡蘿卜素降解物類、類西柏烷類、苯丙氨酸類、新植二烯含量最高。由此可見，煙葉采用真空包裝在一定程度上可抑制TSNAs的形成和積累，且煙葉香氣品質較好。

表1 不同包裝方式的白肋煙中性香氣成分的變化Tab. 1 Changes of neutral aroma constituents in burley tobacco under different packaging methods

2.2 真空包裝對不同類型煙葉樣品葉片和煙梗TSNAs含量的影響

2.2.1 真空包裝對不同類型煙葉樣品葉片和煙梗NNN含量的影響

將不同類型煙葉常規(guī)包裝（紙箱包裝）和真空包裝的葉片和煙梗樣品分別在高溫條件下貯藏15 d后測定NNN含量（圖2），結果表明，4種類型經(jīng)常規(guī)包裝的煙葉樣品在高溫貯藏后NNN含量顯著增加（P＜0.05），真空包裝樣品NNN含量增加幅度顯著降低（P＜0.05），其中雪茄茄芯、茄衣、烤煙和白肋煙葉片NNN含量與常規(guī)包裝樣品相比分別降低39.27%、29.03%、17.62%、29.55%，煙梗NNN含量分別降低50.75%、28.94%、50.43%、32.29%，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。真空包裝樣品高溫貯藏后的NNN的含量一般接近常溫條件下常規(guī)包裝的含量。從圖中可知，烤煙葉片中NNN含量高于煙梗，雪茄茄芯、雪茄茄衣和白肋煙內兩部分含量呈現(xiàn)相反趨勢，貯藏前烤煙葉片中NNN含量是煙梗的14.70倍。雪茄茄芯葉片中NNN含量最高，且高于雪茄茄衣和烤煙葉片內NNN含量，煙梗內NNN含量大小排序為雪茄茄芯＞雪茄茄衣＞白肋煙＞烤煙。

圖2 真空包裝對不同類型煙葉樣品葉片和煙梗NNN含量的影響Fig. 2 Effect of vacuum packaging on NNN content in leaves and stems of different types of tobacco samples

2.2.2 真空包裝對不同類型煙葉樣品葉片和煙梗NAT含量的影響

不同類型煙葉葉片和煙梗NAT含量的測定結果表明（圖3），4種類型煙葉在高溫環(huán)境下經(jīng)真空包裝后NAT含量均較常規(guī)包裝（紙箱包裝）有所降低，雪茄茄衣煙梗經(jīng)真空包裝后效果更顯著（P＜0.05），較常規(guī)包裝降低53.78%，雪茄茄芯、白肋煙、烤煙煙梗分別較高溫常規(guī)包裝下降35.00%、33.33%、13.90%。葉片以白肋煙經(jīng)真空包裝后NAT含量下降幅度更大，較常規(guī)包裝下降44.10%，達顯著水平（P＜0.05）。雪茄茄衣、烤煙和雪茄茄芯葉片經(jīng)真空包裝后較常規(guī)包裝分別下降15.01%、24.24%、42.31%，且差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。煙梗中NAT含量存在差異，白肋煙煙梗中NAT含量最高，其次是雪茄茄芯，烤煙煙梗中NAT含量最低。不同類型煙葉葉片和煙梗中NAT含量高低有所差異，貯藏前烤煙葉片中NAT含量高于煙梗中NAT含量，高溫貯藏后烤煙煙梗中NAT含量增加幅度較大，造成煙梗中NAT含量高于葉片。雪茄茄芯、雪茄茄衣、白肋煙煙梗中NAT含量顯著高于葉片；高溫貯藏后的雪茄茄衣煙梗、白肋煙葉片內NAT含量增加幅度較大。

圖3 真空包裝對不同類型煙葉樣品葉片和煙梗NAT含量的影響Fig. 3 Effect of vacuum packaging on NAT content in leaves and stems of different types of tobacco samples

2.2.3 真空包裝對不同類型煙葉樣品葉片和煙梗NNK含量的影響

測定不同類型煙葉樣品的葉片和煙梗NNK含量如圖4所示，4種類型煙葉抽真空處理后NNK含量均有所降低，且下降幅度均達到顯著水平（P＜0.05），白肋煙降低幅度較大，葉片和煙梗經(jīng)真空包裝后NNK含量較常規(guī)包裝（紙箱包裝）顯著降低45.05%和50.19%（P＜0.05），雪茄茄衣葉片和雪茄茄芯、烤煙煙梗經(jīng)真空包裝后較常規(guī)包裝分別下降52.61%、56.72%、52.65%，下降率達50%以上，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。烤煙煙梗中NNK含量低于葉片中NNK含量，雪茄茄芯、雪茄茄衣、白肋煙葉片NNK含量高于煙梗，貯藏前，雪茄茄衣煙梗內NNK含量為葉片的6.88倍。雪茄茄衣煙梗中NNK含量最高，其次是雪茄茄芯，兩者顯著高于其他兩種煙葉，烤煙中NNK含量最低。高溫貯藏后的煙葉樣品內NNK含量升高效果較常溫貯藏更加顯著。

圖4 真空包裝對不同類型煙葉樣品葉片和煙梗NNK含量的影響Fig. 4 Effect of vacuum packaging on NNK content in leaves and stems of different types of tobacco samples

2.2.4 真空包裝對不同類型煙葉樣品葉片和煙梗NAB含量的影響

測定不同類型煙葉葉片和煙梗貯藏15 d后NAB含量如圖5，從圖中可以看出不同類型煙葉在高溫環(huán)境下使用真空包裝與常規(guī)包裝（紙箱包裝）后，葉片和煙梗內NAB含量的差異均達到顯著水平（P＜0.05），且使用真空包裝后NAB含量的下降程度有所不同，雪茄茄衣的葉片進行抽真空后NAB含量較高溫貯藏下降64.72%，下降效果最顯著（P＜0.05），其次是白肋煙和雪茄茄芯煙梗，與常規(guī)包裝貯藏的煙葉相比分別降低了58.21%和57.63%，且差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；四種類型煙葉葉片和煙梗經(jīng)真空包裝后NAB含量與常溫貯藏后NAB含量差異均未達到顯著水平（P＞0.05）。在兩種不同溫度貯藏條件下NAB含量增加情況存在差異，在高溫環(huán)境下，4種煙葉內NAB含量均呈大幅度增加。白肋煙煙梗NAB含量最高，烤煙葉片和煙梗內NAB含量最低。雪茄茄衣、茄芯、白肋煙煙梗NAB含量顯著高于葉片內NAB含量，烤煙則相反。

圖5 真空包裝對不同類型煙葉樣品葉片和煙梗NAB含量的影響Fig. 5 Effect of vacuum packaging on NAB content in leaves and stems of different types of tobacco samples

2.2.5 真空包裝對不同類型煙葉樣品葉片和煙梗TSNAs總量的影響

將不同類型煙葉常規(guī)包裝（紙箱包裝）和真空包裝的葉片和煙梗樣品分別在高溫條件下貯藏15 d后測定TSNAs總量（圖6），不同類型煙葉的葉片和煙梗在經(jīng)過真空包裝后，TSNAs總量較常規(guī)包裝得到了不同程度的降低，且下降程度均達到顯著水平（P＜0.05），以雪茄茄芯煙梗下降幅度最大，較高溫貯藏顯著下降44.80%（P＜0.05），雪茄茄衣、烤煙和白肋煙煙梗TSNAs總量別較常規(guī)包裝降低35.86%、38.29%、20.84%，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。煙葉葉片以白肋煙下降幅度最大，較常規(guī)包裝高溫貯藏顯著降低40.65%（P＜0.05），雪茄茄芯、雪茄茄衣、烤煙葉片內TSNAs總量分別下降38.52%、28.57%、21.52%。不同類型煙葉內葉片和煙梗中TSNAs總量高低情況與NNN、NAB、NAT、NNK相似，雪茄茄衣、雪茄茄芯、白肋煙煙梗TSNAs總量高于葉片，烤煙葉片內TSNAs含量較高。4種煙葉樣品煙梗TSNAs總量大小排列如下：白肋煙＞雪茄茄芯＞雪茄茄衣＞烤煙。不同類型煙葉樣品TSNAs總量于高溫貯藏后含量大幅度增加，與4種TSNA情況相似。

圖6 真空包裝對不同類型煙葉樣品葉片和煙梗TSNAs含量的影響Fig. 6 Effect of vacuum packaging on TSNAs content in leaves and stems of different types of tobacco samples

3 討論

煙草特有亞硝胺是煙葉中重要的特有的有害成分，在長期貯藏過程中煙草特有亞硝胺含量表現(xiàn)出持續(xù)增加的趨勢，表明貯藏環(huán)節(jié)是TSNAs形成的主要時期之一，也是采取人工措施降低煙葉TSNAs積累的關鍵時期[39,27-28]。不同類型煙葉以及煙葉的葉片和煙梗之間TSNAs含量差異很大，這一方面體現(xiàn)在新調制后的煙葉TSNAs含量有差異，另一方面也體現(xiàn)在煙葉貯藏過程中TSNAs形成量的不同。不同類型煙葉相比，烤煙TSNAs含量較低，且在煙葉貯藏過程中增加幅度較小，這與其煙葉采用烘烤的方式進行調制和煙葉硝態(tài)氮含量較低有關[40,33]，白肋煙、雪茄煙采用自然條件下晾制的調制方法，調制時間長，且煙葉硝態(tài)氮含量高，因此調制后和貯藏后的煙葉TSNAs含量增加幅度較大。煙葉葉片和煙梗都可用于卷煙生產(chǎn)，二者在化學組成上差別較大，煙梗的硝態(tài)氮含量顯著高于葉片，但生物堿含量卻低于葉片[41,34]，這直接影響到貯藏前和貯藏過程中TSNAs的形成，其中烤煙葉片的TSNAs含量高于煙梗，但白肋煙和雪茄煙等晾曬煙則是煙梗的TSNAs含量顯著高于葉片，這種差異性主要與調制方式有關，但無論是烤煙還是晾曬煙，在貯藏過程中TSNAs的增幅都表現(xiàn)為煙梗大于葉片，這可能主要是由于煙梗硝態(tài)氮含量遠高于葉片所致，特別是在高溫貯藏條件下，本實驗室前期研究表明，高溫促使硝態(tài)氮產(chǎn)生氣態(tài)氮氧化物，進而與生物堿發(fā)生亞硝化反應是高溫貯藏過程TSNAs形成的主要機理[28,35]。

前人研究表明，由生物堿發(fā)生亞硝化反應生成TSNAs的反應是一種氧化反應，需要氧的參與[29-31]，去除貯藏環(huán)境中的NOx和氧氣可能會對抑制TSNAs的形成有一定的作用。該研究中，無論是在高溫環(huán)境中還是常溫的條件下，經(jīng)過真空包裝后貯藏的不同類型的煙葉葉片煙梗中TSNAs的含量顯著低于未經(jīng)真空包裝的煙葉。經(jīng)過一年貯藏后，經(jīng)真空包裝處理后貯藏的白肋煙葉與另外兩種貯藏方式相比較，其TSNAs的增幅最小，由此可見煙葉真空狀態(tài)在一定程度上可抑制TSNAs的生成，這可能與采用真空包裝后有效地隔絕空氣，減少空氣的氧化作用有關。該研究為在煙葉貯藏階段降低TSNAs的生成，進而提高煙葉及制品的安全性提供了新的思路和方法。

4 結論

煙葉和煙梗采用真空包裝方式進行貯藏，可有效地隔絕空氣，顯著抑制TSNAs的形成和積累，TSNAs增加量顯著低于未經(jīng)真空包裝的煙葉，且煙葉中性致香成分含量較高。因此在雪茄煙、白肋煙和烤煙煙葉和煙梗長期貯藏過程中，采用真空包裝有利于減少有害物質的形成，提升優(yōu)質低害煙葉原料保障水平。