外源添加麝香草酚提高煙草幼苗抵御鹽脅迫機理的研究

宋佳倩，徐亮，王悅霖，葉協鋒，鐘釧，李均，鐘子正，姚鵬偉，王靜*，盧劍

1 河南農業大學煙草學院，國家煙草栽培生理生化研究基地，煙草行業煙草栽培重點實驗室，鄭州市金水區文化路95號 450002；

2 四川省涼山州會東縣煙草公司，涼山彝族自治州會東縣金葉街66號 615200；

3 四川省涼山州煙草公司西昌市公司，涼山彝族自治州西昌市三岔口東路368號 615000

近年來，由于農業生產中的不合理灌溉、過量施用化肥等因素，土壤次生鹽漬化問題愈發嚴重[1]，農業生產與可利用耕地間的矛盾日益加劇，特別是在沿海地區以及干旱和半干旱地區，土壤鹽漬化成為限制農業發展的一個重要因素[1-2]。有研究表明，植煙土壤鹽分離子表聚現象嚴重，出現不同程度的鹽漬化，極個別地區的土壤甚至屬于中度鹽漬化[3-4]。土壤中鹽分含量過高嚴重影響植物生長，引起鹽脅迫。鹽脅迫能夠抑制植物生長發育，最直觀的表現為抑制種子萌發[5]，抑制根和莖的生長[6-7]，降低光合速率[8]，減少生物量[9]等。

植物根系的發育具有高度可塑性，這使得植物能夠更好的適應各種環境脅迫。根系作為吸收水分和營養物質的器官，最先感知到逆境脅迫信號[10]。鹽脅迫通過抑制根的伸長[11-12]、根活[13]、根毛發育[14]等影響根系的生長。當植物受到鹽脅迫時，植株吸水困難，從而導致生理性干旱；植物從土壤中吸收過多的Na+，從而產生離子毒害，打破植株的離子平衡，影響植物對必需礦質元素的吸收；鹽脅迫導致植物積累大量的活性氧，其產生的氧化脅迫還會破壞質膜結構，抑制蛋白合成，促進葉綠體的分解，嚴重的可導致植株死亡[15-17]。為避免高鹽環境造成的傷害，植物利用抗氧化酶清除系統來緩解氧化脅迫，超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）[18]是酶促抗氧化系統的主要酶類，SOD將超氧陰離子歧化成過氧化氫，POD和CAT將過氧化氫分解為水。

通過外源化學物質調控來減輕鹽脅迫對植物的傷害,增強植物的耐鹽性,是緩解鹽脅迫的一種重要方式。麝香草酚（5-甲基-2-異丙基苯酚）是從麝香草中提取出來的精油中的重要成分[19]，具有消炎、殺菌、抗氧化等特性，在醫藥領域被廣泛使用[20]。作為一種新型天然植物源化合物，已有研究表明麝香草酚在調控植物逆境脅迫方面具有一定的功效，Cheng[21]等研究證實麝香草酚通過激活抗氧化防御和調節Na+在水稻根中的動態平衡來提高對鹽脅迫的耐受性；Ye等[22]研究發現麝香草酚處理可阻斷鎘誘導的活性氧的過度生成、脂質過氧化和膜完整性的喪失，減輕鎘對煙草幼苗生長的抑制作用；麝香草酚對西瓜枯萎病[23]、禾谷鐮孢菌[24]等同樣具有良好的防效，但對其調控逆境脅迫機理的深入研究卻鮮有報道。

非損傷微測技術（Non-invasive Micro-test Technology，NMT）能夠以近似生理條件的液體環境原位檢測進出活體樣品離子、分子流速，對樣品組織或細胞內部生理活動不會造成任何干擾和破壞[25]，近年來常被用于植物體生命活動規律以及植物與環境間的互作關系研究。本研究通過化學染色法和非損傷微測法，對煙草根尖進行細胞學和鈉鉀離子流速的測定，并結合煙草幼苗根長、活性氧含量、抗氧化酶含量等生理指標，探究麝香草酚緩解煙草幼苗鹽脅迫的機理，以期為提高植物耐鹽性研究以及鹽堿土壤改良提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

供試煙草品種為K326。試驗設置4個處理：正常的MS培養基為對照（CK）；處理一：MS培養基+150 mmol/L NaCl（S）；處理二：MS培養基+50 μmol/L麝香草酚（T）；處理三：MS培養基+150 mmol/L NaCl+50 μmol/L麝香草酚（ST）。鈉鉀離子流速測定采用同樣的處理，MS培養基用霍格蘭營養液替換。每個處理均設置三次生物學重復。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料培養種子消毒與培養方法參照王悅霖等[5]。培養6～7 d時選取長勢一致的幼苗進行處理。

1.2.2 根長的測定分別于處理12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h后測量幼苗根長增長量并拍照。

1.2.3 選取培養基上培養7 d的幼苗，加處理72 h后，每個處理各取10株幼苗測定SOD、POD和CAT活性，MDA、H2O2含量等指標，測定均采用蘇州科銘生物技術有限公司的試劑盒，試驗方法參照試劑盒說明書。

1.2.4 根尖細胞死亡染色

根尖的細胞死亡染色參考Duan[26]的方法，選用特異性染料臺盼藍，它能夠穿透破損的細胞膜將死亡細胞染成藍色，而不能對健康活細胞進行染色。將處理72 h的幼苗轉移到臺盼藍（Trypan blue）溶液中培養20 min（25℃，光照）。用去離子水洗去浮色，在體視顯微鏡下對根尖進行觀察并拍照。

1.2.5 鈉鉀離子流速測定

將種子播于蒸餾水浸濕的濾紙上，置于光照培養箱（溫度25℃，光/暗16 h/8 h，光照強度4950 Lx，相對濕度60%），培養7 d后選取長勢一致的幼苗轉移到1/2霍格蘭營養液中，2 d后換正常的霍格蘭營養液，之后每隔兩天更換一次營養液。培養至30 d，用于鈉鉀離子流速測定。

在處理12 h后取根系頂端幼嫩部位，葉片撕掉表皮，露出葉肉位置，固定于滅菌的小培養皿中，加入離子流速基本測試液，根系平衡30 min，葉片平衡6 h，電極運動一次間距為30 μm，運動頻率為0.3～0.5 Hz，每個處理6次重復。采用非損傷微測系統進行鈉鉀離子流速測定，利用ASET2.10軟件進行數據顯示、圖像獲取、數據的預處理、電極三維位置調試和顯微鏡精細聚焦等操作。

1.3 數據分析

采用Excel 2003和DPS 7.05軟件進行數據處理和顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著；數據采用GraphPad Prism v 8.3軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 外源添加麝香草酚對鹽脅迫下煙草根長的影響

根系作為吸收水分和營養物質的重要器官，最先感知到逆境脅迫信號[27]，因此，根長常被用來評估植物根的生長狀況。結果表明，T處理的根長增長量在處理48 h后顯著低于對照處理，但仍然顯著高于S處理，S處理各處理時間段煙草幼苗的根長增長量均顯著低于對照（圖1），其中處理72 h的根長增長量與CK相比下降了60.89%，而ST處理的根長增長量均高于S處理，且均達到了顯著水平（圖2）。表明添加麝香草酚緩解了鹽脅迫對幼苗根系的生長抑制。

圖1 外源添加麝香草酚對煙草幼苗根長增長量的影響Fig.1 Effect of exogenous thymol on root length growth of tobacco seedlings

圖2 外源添加麝香草酚對鹽脅迫下煙草幼苗根生長的影響（處理72 h）Fig.2 Effect of exogenous thymol on root growth of tobacco seedlings under salinity stress (treated for 72 h)

2.2 外源添加麝香草酚對鹽脅迫下煙草MDA與H2O2含量以及抗氧化酶活性的影響

鹽脅迫會造成植物體內活性氧含量升高，對細胞膜系統造成損傷[28]。本研究結果顯示，處理72 h后，S處理與CK相比H2O2含量升高了136.91%、MDA含量增加了37.74%，均達到顯著水平，ST處理的MDA含量與對照無顯著差異，而H2O2含量則顯著高于對照，但總體來說，ST處理的MDA和H2O2含量均顯著低于S處理（圖3）。從圖4可以看出，處理72 h后，與CK相比鹽脅迫顯著提高了SOD、POD、CAT的活性，分別提高了47.47%、93.23%、238.60%。ST處理抗氧化酶活性也顯著升高，但沒有S處理增加的多，分別提高了15.84%、25.26%和41.49%。表明添加麝香草酚緩解了鹽脅迫造成的H2O2積累和膜脂過氧化損傷。

圖3 外源添加麝香草酚對鹽脅迫下煙草H2O2和MDA含量的影響Fig.3 Effects of exogenous thymol on the contents of H2O2 and MDA in tobacco under salinity stress

圖4 外源添加麝香草酚對鹽脅迫下煙草SOD、POD、CAT活性的影響Fig. 4 Effect of exogenous thymol on activity of SOD, POD and CAT activities of tobacco under salinity stress

2.3 外源添加麝香草酚對鹽脅迫下煙草根尖細胞死亡的影響

如圖5所示，對照條件下的煙草幼苗根尖被輕微染色，說明根在正常的生長發育過程中存在自然的細胞死亡代謝過程；S處理72 h后，根尖染色明顯加重，說明鹽脅迫導致了根尖細胞死亡加劇；而ST處理細胞死亡現象得到明顯緩解；T處理對根尖細胞死亡無顯著影響。

圖5 不同處理煙草幼苗根尖細胞的染色情況Fig. 5 Staining of root tip cells of tobacco seedlings under different treatments

2.4 外源添加麝香草酚對鹽脅迫下Na+、K+流速的影響

細胞內鈉鉀平衡對植物的耐鹽性起關鍵作用[29]。如圖6所示，處理12 h后，在霍格蘭營養液培養條件下，煙草根系表現為Na+吸收，S處理Na+吸收凈流量顯著增加，而ST處理與T處理的Na+流速均表現為外排，且ST處理的Na+外排凈通量顯著大于T處理，表明麝香草酚能夠促進Na+外排，緩解鹽脅迫造成的Na+內流。對同一煙株葉片中Na+流速的檢測發現，正常霍格蘭營養液培養條件下表現為Na+吸收，其他三個處理均表現為外排，且ST處理Na+的外排顯著低于S處理。這可能是由于單獨鹽脅迫處理根系Na+吸收增多，運輸到地上部后排出，故鹽脅迫下地上部Na+外排增加，而鹽脅迫與麝香草酚處理地上部Na+外排量較小。

圖6 外源添加麝香草酚對鹽脅迫下煙草Na+流速的影響Fig. 6 Effect of exogenous thymol on Na+ flow rate of tobacco under salinity stress

由圖7可知，CK處理與T處理的煙草根系K+流速均為輕度外排，ST處理的K+外排凈流量明顯低于S處理；葉片中CK處理與T處理的K+為吸收，鹽脅迫處理以及鹽脅迫與麝香草酚混合處理后的K+為外排，且鹽脅迫處理的K+外排凈流量明顯高于鹽脅迫與麝香草酚混合處理，表明麝香草酚的添加緩解了鹽脅迫造成的K+流失。

圖7 外源添加麝香草酚對鹽脅迫下煙草K+流速的影響Fig.7 Effect of exogenous thymol on K+ flow rate of tobacco under salinity stress

3 討論

本研究結果顯示，鹽脅迫導致了大量活性氧累積，誘發了根尖細胞死亡，而麝香草酚的添加能夠通過提升煙草幼苗的抗氧化能力，緩解鹽脅迫引發的根長抑制和細胞死亡效應。此外，鹽脅迫處理下SOD、POD和CAT的活性顯著升高，這與付晴晴等[30]的研究結果一致，表明活性氧的過量積累激活了煙草的抗氧化系統，麝香草酚與NaCl共處理的SOD、POD和CAT活性要低于單獨NaCl處理，推測可能是由于麝香草酚與NaCl共處理誘導產生的活性氧水平低于單獨NaCl處理。抗氧化酶活性測定的結果表明，鹽脅迫下麝香草酚的添加沒有刺激煙草幼苗SOD、POD和CAT的活性的進一步升高，表明麝香草酚對煙草鹽脅迫的緩解作用不是通過提高抗氧化酶系統來完成，而是通過抑制活性氧的產生實現的，這與葉協鋒等[22]的研究一致。

當面對高鹽脅迫時，植物體內做出相應的調整以提高自身的生存能力。有研究表明植物在高鹽環境下，胞質中大量積累的Na+會打破原有的Na+/K+平衡，降低植物維持細胞內外離子平衡的能力，進而阻礙其他離子的吸收，最終影響植物的代謝[31]。Deinlein等研究表明，植物可以通過排除Na+和分隔Na+來解除過量的Na+脅迫[32]。本研究發現，鹽脅迫處理12 h后根系吸收大量的Na+，而鹽和麝香草酚混合處理后Na+從吸收轉為外排；添加麝香草酚處理條件下，根系Na+流速表現為外排，表明添加麝香草酚能夠緩解根系因吸收過多的Na+而產生的離子毒害，從而緩解鹽脅迫。相反地，鹽脅迫下葉片的Na+外排，表明根系吸收的Na+通過中柱鞘運輸到地上部后，通過質膜排出胞外，NaCl與麝香草酚共處理的Na+外排低于鹽脅迫處理。推測麝香草酚的添加使根系吸收更少的Na+，使得煙株并沒有通過根系吸收過多的Na+，因此地上部的Na+外排較鹽脅迫處理減弱。此外，鹽脅迫初期產生的活性氧能夠激活質膜非選擇性陽離子通道，造成K+的流失[33-36]。本研究發現，鹽脅迫處理的根系K+流速為明顯的外排，添加麝香草酚后K+的外排量明顯降低，表明麝香草酚能夠在一定程度下緩解鹽脅迫造成的K+流失，但不能恢復至對照水平，這對于鹽脅迫下植物的生長仍然是有益的。

4 結論

鹽脅迫容易導致煙草幼苗根系大量活性氧累積，并誘發根尖細胞死亡。麝香草酚能夠通過提升煙草幼苗的抗氧化能力，緩解鹽脅迫引發的根長抑制和細胞死亡效應；另一方面麝香草酚可以降低鹽脅迫造成的Na+吸收和K+外排，從而維持細胞內鈉鉀平衡，對植株的耐鹽性具有積極的作用。