基于RAPD分子標(biāo)記的煙草青枯病菌特異引物篩選及效果評(píng)價(jià)

李小杰，劉暢，李成軍，楊立均，邱睿，宋瑞芳，陳玉國(guó)，白靜科，李淑君*

1 煙草行業(yè)黃淮煙區(qū)煙草病蟲(chóng)害綠色防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，許昌 461000；

2 河南省煙草公司駐馬店市公司，駐馬店 463000；

3 中國(guó)煙草總公司河南省公司，鄭州 450018

青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）寄主范圍廣，可侵染50多科200多種植物[1]。煙草青枯病是危害世界煙草生產(chǎn)的重要根莖部細(xì)菌性病害，主要發(fā)生在我國(guó)長(zhǎng)江流域及以南煙區(qū)，造成巨大損失[2,3]。近年來(lái)由于全球氣候變暖，該病害已在河南、安徽、山東、陜西等地有不同程度的發(fā)生[4-7]。

煙草青枯病屬于系統(tǒng)侵染的維管束病害，一旦發(fā)病很難得到有效控制。因此，如何在早期快速有效地檢測(cè)青枯病菌對(duì)于防止青枯病蔓延和有效控制顯得尤為重要。目前對(duì)于煙草青枯病的檢測(cè)大多采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法和血清學(xué)鑒定法。其中，傳統(tǒng)的鑒定方法需要分離得到純化的單菌落菌株，檢測(cè)過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng)，很容易錯(cuò)過(guò)病害的最佳防治時(shí)間，對(duì)指導(dǎo)生產(chǎn)的意義不大。而血清學(xué)方法主要是利用特異的血清抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)，且隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展已研制出高靈敏度的青枯病菌檢測(cè)試紙條，對(duì)早期青枯病的快速檢測(cè)起到了重要作用[8]，但該方法制備抗體過(guò)程耗時(shí)耗力，成本較高，且極有可能存在交叉反應(yīng)，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性[9]。現(xiàn)代分子生物學(xué)方法可以不依賴于病原菌的純培養(yǎng)和特異抗體的制備而對(duì)樣品中的病原進(jìn)行直接檢測(cè)，可在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)到極微量的病原，大大提高了病原的檢測(cè)效率。

目前利用RT-qPCR、LNA-qPCR、巢氏PCR等分子技術(shù)對(duì)青枯病菌進(jìn)行檢測(cè)的報(bào)道已有很多[10-14]，其檢測(cè)關(guān)鍵是設(shè)計(jì)特異性引物。如楊嬌弟等[15]根據(jù)已公布的5個(gè)青枯菌全基因組比對(duì)結(jié)果，篩選并驗(yàn)證得到3對(duì)引物能對(duì)土壤中煙草青枯菌進(jìn)行特異性檢測(cè)。郭淼淼等[16]分別以R. solanacearum染色體上的16S rDNA ITS以及毒性質(zhì)粒攜帶的致病性相關(guān)基因fliC為靶點(diǎn)，篩選獲得特異性擴(kuò)增青枯菌的引物對(duì)RaITS-1/2和RalfliC-F/R，均能夠穩(wěn)定、快速、靈敏地檢測(cè)青枯菌DNA。

青枯雷爾氏菌存在明顯的生理分化，根據(jù)寄主范圍差異，可分為5個(gè)生理小種[17,18]。根據(jù)生理小種劃分標(biāo)準(zhǔn)，煙草青枯病菌屬于寄主范圍廣泛的生理小種1號(hào)[17,19]。本研究利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)，針對(duì)豫南煙區(qū)煙草青枯病菌1號(hào)生理小種III型生物型，篩選特異性片段并進(jìn)行特異引物的設(shè)計(jì)，同時(shí)對(duì)其特異性和靈敏度進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，以期為河南省煙草青枯病的早期診斷和快速檢測(cè)提供方法。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和煙草品種

煙草青枯病菌（R. solanacearum）、多粘芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、節(jié)桿菌（Arthrobacter）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。煙草野火病菌由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院蔣士君教授惠贈(zèng)。煙草品種中煙100和云煙87種子由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所育種研究室提供。

1.2 基因組DNA的提取

細(xì)菌、植物和土壤基因組總DNA的提取分別按照天根生物公司細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（DP302）、植物基因組DNA提取試劑盒（DP305）和土壤基因組DNA提取試劑盒（DP336）說(shuō)明書方法操作。

1.3 特異性引物設(shè)計(jì)、篩選與擴(kuò)增

利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)，以煙草青枯病菌、煙草野火病菌、多粘芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、節(jié)桿菌、熒光假單胞菌和煙草栽培品種云煙87、中煙100的基因組DNA為模板，利用隨機(jī)引物篩選煙草青枯病菌的特異片段，將獲得的特異片段送生工生物（上海）進(jìn)行測(cè)序分析，再根據(jù)特異片段序列設(shè)計(jì)特異引物，引物合成由生工生物（上海）完成。RAPD反應(yīng)體系（25 μL）：模 板DNA約50 ng，200 μmol/L dNTP，1.5 nmol/L MgCl2，0.1 μmol/L引物，200 μmol /L Ex-Taq DNA polymerase和1×PCR buffer；PCR擴(kuò)增條件為：95℃ 5 min，94℃ 45 s，37℃ 90 s，72℃ 2 min，41

個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.4 特異引物檢測(cè)的靈敏度測(cè)定

青枯菌菌液最低檢出濃度的測(cè)定 將青枯菌置于28℃搖床上過(guò)夜培養(yǎng)，以1 mL OD600≈1.0的細(xì)菌懸浮液中青枯菌數(shù)量為109個(gè)細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)，梯度稀釋細(xì)菌懸浮液，形成109cfu/mL，108cfu/mL，107cfu/mL，…，10 cfu/mL梯度細(xì)菌懸浮液。同時(shí)以青枯菌基因組DNA為模板（模板濃度為42 ng/μL），并將模板進(jìn)行101、102、103、104、105倍稀釋，形成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀釋液。分別吸取1 μL菌液或DNA為模板，利用篩選出的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行電泳檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：模板1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，2×PCR Taq MasterMix 12.5 μL，雙蒸水補(bǔ)足到25 μL。PCR擴(kuò)增條件：95℃ 3 min；94℃ 45 s，退火溫度 45 s，72℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。

土壤中青枯菌最低檢出量的測(cè)定 將青枯菌置于28℃搖床上過(guò)夜，以O(shè)D600=0.5的細(xì)菌懸浮液中青枯菌數(shù)量為3×108cfu/mL的標(biāo)準(zhǔn)，梯度稀釋到3×107

cfu/mL、3×106cfu/mL、3×105cfu/mL、3×104cfu/

mL。分別吸取1 mL菌液加入5 g已滅菌的土壤中，過(guò)夜培養(yǎng)。稱取0.2 g土壤提取總DNA，稀釋一定倍數(shù)后作為模板，利用篩選出的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。剩余4.8 g含菌土壤中加入45 mL水于搖床上震蕩10 min，混勻后即為10-1土壤懸浮液，按梯度稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5倍土壤懸浮液，分別吸取1 μL上清做模板進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件同上。

1.5 盆栽接種后土壤和煙株體內(nèi)青枯病菌的檢測(cè)

將土壤高溫滅菌后風(fēng)干得到無(wú)菌土，選擇健康的長(zhǎng)至4-6片葉的煙株移栽于裝有250 g無(wú)菌土的盆缽中（直徑為上口徑95 mm×高 75 mm）。采用傷根灌根法，每株煙苗灌青枯菌菌懸液（3×108cfu/mL）10 mL，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種5株煙苗，以清水為對(duì)照處理。于接種后7 d進(jìn)行病害調(diào)查和取樣，青枯病分級(jí)參照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《煙草病蟲(chóng)害分級(jí)及調(diào)查方法》（GB/T23222-2008）進(jìn)行調(diào)查。分別取煙株根際土壤和煙株莖基部組織（根部向上1～2 cm處）各0.1 g，加入0.9 mL無(wú)菌水進(jìn)行研磨，制成懸浮液作為模板，利用特異引物擴(kuò)增檢測(cè)接種土壤和煙株體內(nèi)青枯病菌的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草青枯菌特異片段的獲得

利用RAPD隨機(jī)引物對(duì)8個(gè)供試基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明擴(kuò)增條帶表現(xiàn)出明顯的多態(tài)性，從1000多個(gè)隨機(jī)引物中篩選出能夠擴(kuò)增出煙草青枯病菌特異片段的引物6個(gè)（表1、圖1）。測(cè)序結(jié)果表明，這6個(gè)特異片段分別代表青枯菌基因組中不同的基因序列，其片段大小和靶基因名稱見(jiàn)表1。

表1 煙草青枯病菌特異片段的篩選Tab. 1 Screening of specific fragment of R. solanacearum

圖1 RAPD隨機(jī)引物的PCR擴(kuò)增Fig. 1 PCR amplification of RAPD random primers

2.2 煙草青枯菌特異引物的設(shè)計(jì)與篩選

利用Primer 5.0軟件，根據(jù)特異片段序列設(shè)計(jì)特異引物，共篩選出特異性擴(kuò)增煙草青枯病菌的引物6對(duì)（表2）。電泳檢測(cè)結(jié)果表明，篩選出的特異引物只在煙草青枯病菌基因組DNA中擴(kuò)增出條帶，且條帶明亮單一，無(wú)雜帶（圖2）。

表2 煙草青枯病菌特異引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小Tab. 2 Specific primer sequence and amplification product size of R. solanacearum

圖2 煙草青枯菌特異引物的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 2 Results of PCR amplification by specific primers for R. solanacearum

2.3 煙草青枯病菌菌液最低檢出濃度

利用篩選出的特異引物對(duì)，分別以煙草青枯病菌不同稀釋度的菌液和基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，對(duì)于基因組DNA，引物對(duì)A1T-F/R、

A6T-F/R、A7T-F/R、S6T-F/R、S13T-F/R、S18T-F/R檢測(cè)的靈敏度均可達(dá)到105的稀釋度，即0.42 pg/μL。對(duì)于青枯病菌菌液，引物對(duì)A1T-F/R、A6T-F/R、A7T-F/R、S13T-F/R能檢測(cè)到的最低濃度為105cfu/mL，引物對(duì)S6T-F/R、S18T-F/R能檢測(cè)到的最低濃度為106cfu/mL（圖3）。

圖3 特異引物的靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig. 3 Results of sensitivity test for specific primers

2.4 土壤中煙草青枯菌的最低檢出量

分別從每克土含菌量為1.2×107cfu、1.2×106cfu、1.2×105cfu、1.2×104cfu、1.2×103cfu的土壤中提取總DNA，并以稀釋50倍的DNA為模板進(jìn)行特異引物的PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，利用特異引物對(duì)S13T-F/R擴(kuò)增檢測(cè)的青枯菌最低含量為每克土含菌量為6×102cfu。對(duì)于土壤懸浮液，特異引物對(duì)S13T-F/R檢測(cè)的最低濃度為102稀釋度，即約3×106cfu/mL（圖4）。其他5對(duì)特異引物的擴(kuò)增結(jié)果與S13T引物一致。

圖4 特異性引物對(duì)S13T-F/R對(duì)土壤中青枯菌的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 4 Results of PCR amplification for R. solanacearum in soil by S13-TY pairs

2.5 煙草發(fā)病植株和土壤的快速檢測(cè)

接種青枯病菌后7 d，分別取不同發(fā)病程度的煙株和根際土壤，利用特異引物對(duì)A1T-F/R和S13T-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖5）。結(jié)果表明，接種的煙株根際土壤中均能擴(kuò)增出青枯病菌的特異條帶。對(duì)于煙株而言，只在病級(jí)為5的煙株中檢測(cè)到青枯病菌，而健康煙株和病級(jí)為1的煙株中未檢測(cè)出青枯病菌。由此說(shuō)明，篩選出的特異引物不需提取土壤和中等發(fā)病煙株的總DNA，樣品加水研磨的懸浮液即可直接用于快速檢測(cè)。

圖5 土壤和煙株體內(nèi)青枯病菌的PCR檢測(cè)Fig. 5 PCR detection of R. solanacearum in tobacco planting soil and tobacco plant

3 結(jié)論與討論

目前RAPD（Random amplified polymorphisms DNA）分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于品種鑒定、育種、基因定位、遺傳多樣性、種質(zhì)差異等研究領(lǐng)域[20-23]，同時(shí)也可用于植物病原菌的分子診斷[24-27]，但利用該技術(shù)對(duì)煙草青枯病菌進(jìn)行特異引物篩選還鮮有報(bào)道[27]。雖然青枯病菌的分子檢測(cè)方法多樣，但使用方法不同，對(duì)青枯病菌的檢測(cè)靈敏度也有所差別。如黃雯等[28]根據(jù)青枯菌的lpx C基因序列設(shè)計(jì)得到4條LAMP特異性引物，對(duì)青枯菌的檢測(cè)靈敏度為1.42 pg/μL基因組DNA；程承等[15]利用RT-qPCR檢測(cè)方法，對(duì)試驗(yàn)土壤煙草青枯菌的最低檢測(cè)濃度為5×102cfu/g土壤；李本金等[17]利用煙草青枯病菌的特異引物RsF/RsR與細(xì)菌通用引物L(fēng)1/L2進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，其檢測(cè)靈敏度在DNA水平上可達(dá)0.4 fg/μL。本研究利用RAPD技術(shù)獲得煙草青枯病菌的特異片段6個(gè)，通過(guò)引物設(shè)計(jì)，最終得到6對(duì)煙草青枯菌特異引物，其擴(kuò)增條帶明亮單一，特異性強(qiáng)。經(jīng)對(duì)6種細(xì)菌（煙草青枯病菌、多粘芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、節(jié)桿菌、熒光假單胞菌、野火病菌）和2個(gè)煙草品種（中煙100和云煙87）的檢測(cè)驗(yàn)證，所有引物的靈敏度在DNA水平上均可達(dá)到0.42 pg/μL，對(duì)煙草青枯菌懸液最低檢出率為105～106cfu/mL，這與楊姣弟等[18]的研究結(jié)果基本一致。同時(shí)篩選出的6對(duì)引物能夠特異且高效地檢測(cè)土壤中的青枯菌含量，最低檢出量為6×102cfu/g土壤總DNA，但對(duì)土壤懸浮液的檢測(cè)靈敏度略低，這可能是由于土壤懸浮液作為模板，其復(fù)雜的成分影響了PCR反應(yīng)導(dǎo)致擴(kuò)增效率低造成的。

本研究篩選出的特異引物對(duì)A1T-F/R和S13T-F/R可直接用于接種土壤和中等發(fā)病煙株中青枯病菌的分子檢測(cè)，無(wú)需提取樣品DNA，效率更高，為河南省煙草青枯病的早期診斷提供了重要依據(jù)。但是輕微發(fā)病的煙株中未檢測(cè)到青枯病菌，這可能是由于直接以煙株的組織研磨液模板，導(dǎo)致菌含量較低所造成的，因此青枯菌含量檢測(cè)的靈敏性與煙株發(fā)病程度之間的關(guān)系還需進(jìn)一步研究，以便為煙草青枯病的監(jiān)測(cè)預(yù)警提供理論依據(jù)。另外，本研究設(shè)計(jì)的青枯病菌特異引物，只針對(duì)寄主為河南省主栽煙草品種中煙100和云煙87、生理小種為1號(hào)、生物型為III型的煙草青枯病菌，是否適用于其他寄主或生理小種的青枯病菌的檢測(cè)，還需進(jìn)一步測(cè)試。