乙醛脫氫酶2(ALDH2)基因多態性與血尿酸相關性的臨床觀察

胡晨鳴，余壽益，莫巧璇，賴錦蘭

(佛山市中醫院，廣東 佛山 528000)

0 引言

根據2019 年中國高尿酸血癥與痛風診療指南[1]，目前中國大陸高尿酸血癥的總體患病率13.3%，患病人數已經超過1.8 億，患病人數甚至已超過糖尿病。痛風的總體患病率約1.1%，患病人數超過1500 萬。高尿酸血癥患病率的高低受經濟發展程度、環境、飲食習慣、種族、遺傳等多種因素的影響，呈現一定的特征：年輕化、“重男輕女”、遺傳傾向、地區與種族差異[2]。臨床診療過程中發現，約90%入院治療的急性痛風患者的誘因多是攝入高嘌呤含量的食物、氣候變化、飲酒、果糖攝入過多、運動過度等生活因素，足以看出生活因素對痛風的重大影響。其中，酒精是比食物更重要的危險因素，血尿酸水平隨著酒精攝入量的增加而增加，多因素分析發現，日常飲酒中，每增加10g 的酒精，痛風的發生風險增加17%。

乙醇代謝的整個過程中有兩個關鍵酶：將乙醇氧化為乙醛的乙醇脫氫酶ADH、將乙醛進一步氧化為乙酸的乙醛脫氫酶ALDH。ALDH 基因編碼多個同工酶，乙醛的氧化速度主要受活性最強的ALDH2 調控。研究發現，ALDH2 基因12 外顯子第1510 位點的鳥嘌呤核苷酸G 被腺嘌呤核苷酸A 替換時，ALDH2 基因編碼的蛋白質第487 位氨基酸發生Glu 到Lys的變化，進而導致其編碼的酶活性喪失或降低，ALDH2 基因A 等位基因是顯性遺傳[3]。相較于野生基因型ALDH2*1/*1，雜合子ALDH2*2/*1 和純合突變基因型ALDH2*2/*2 基因所編碼的酶蛋白都沒有活性，對乙醇代謝的影響幾乎相同。

ALDH2*2/*1 和ALDH2*2/*2 基因型個體飲酒后的表現形式為面紅反應，表面上看該位點的多態性使突變等位基因攜帶者的酒精代謝異常，但另一方面存在該基因多態性人群由于飲酒后馬上出現的不舒適感受會減少酒精的攝入，從而使該位點的突變成為飲酒行為的保護因子，而野生基因型ALDH2*1/*1 個體飲酒后不會馬上出現不舒適感，因此飲酒量及次數往往會多于ALDH2*2/*1 和ALDH2*2/*2 基因型個體[4,5]。酒精對血尿酸的影響不僅取決于飲酒量還與酒精代謝的酶相關，本研究旨在了解廣東省無降尿酸治療史、平均每天飲酒量約25mL(隨訪中自報告飲酒量)人群的不同ALDH基因型(第504 位Glu 突變為Lys)與血尿酸的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選自2018 年1 月至2020 年12 月在佛山市中醫院進行ALDH2 基因多態性檢測的人群，平均每天飲酒量為白酒25mL，共153 人。

1.2 試劑與儀器

PCR 儀：AB7500 熒光定量PCR 儀(美國Life Technologies公司)；人類ALDH2 基因檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)購自武漢友芝友醫療科技股份有限公司；核酸提取儀Smart32購自廣州達安醫療有限公司；貝克曼庫爾特AU5831 全自動生化儀。

1.3 外周血DNA 提取

取志愿者的EDTA-K 抗凝靜脈血2mL，提取方法參考廣州和實生物技術有限公司生產的核酸提取試劑盒說明書進行操作：抗凝全血靜置后會出現分層現象，提取前應反復混勻后加200uL 全血在96 孔預裝板的第1 列和第7 列，再加入蛋白酶50uL，在Smart32 核提取酸儀上按照儀器要求的提取程序進行自動化核酸提取，運行結束后第6 列和第12 列對應槽位為相應標本提取的DNA。

1.4 熒光定量PCR 擴增ALDH2 基因

先將ALDH2*2 反應液23μL，加入到200μL PCR 8 聯管內，再依次分別加入基因組DNA、弱陽性對照、空白對照各2μL 到已裝有PCR 反應液的反應管中，待測標本基因組DNA推薦的濃度為5-15ng/ul。蓋好反應管按如下程序擴增：37℃ 10min，95 ℃預變性5min；擴增階 段95 ℃變 性15s，60 ℃延伸60s，共40 個循環。熒光信號的收集定為FAM(ALDH2*2 1502G)，VIC(ALDH2*2 1502A)和ROX(內標)，數據的采集定在60℃。

1.5 ALDH2 基因型判定

陽性對照組的FAM、VIC、ROX 通道Ct值≤32，擴增曲線有明顯指數增長期；空白對照組的FAM、VIC、ROX 通道無擴增曲線，或者擴增曲線為直線或輕微斜線，無明顯指數增長期，無Ct值或Ct值≥38。樣本組有效性的判定標準為：內標基因所有樣本中ROX 通道Ct＜38，擴增曲線有明顯指數增長期。

1.6 血尿酸檢測方法

本研究利用貝克曼庫爾特AU 生化分析系統中配備的尿酸酶-過氧化物酶法檢測血尿酸含量。

1.7 統計學處理

采用SigmaPlot 12 與Excel 統計軟件對數據進行處理。

2 結果

2.1 ALDH2 基因型的檢測

檢測結果判定標準如下：野生基因型ALDH2*1/*1 的FAM 通道Ct值≤36、VIC 通道Ct值＞36 或無Ct值，雜合基因型ALDH2*2/*1 的FAM 通道Ct值≤36、VIC 通 道Ct值≤36，純合突變基因型ALDH2*2/*2 的FAM 通道Ct值＞36 或無Ct值、VIC 通道Ct值≤36，不同基因 型ALDH2的熒光定量PCR 檢測結果如圖1 所示，上圖為野生基因型ALDH2*1/*1、中圖為雜合基因型ALDH2*2/*1、下圖為純合突變基因型ALDH2*2/*2。

圖1 不同基因型ALDH2 的熒光定量PCR 檢測結果

2.2 不同ALDH2 基因型的人數及血尿酸

在檢測人群中，野生基因型ALDH2*1/*1 個體共62 人，其中女性2 人、男性60 人；雜合基因型ALDH2*2/*1 個體共61 人，女性7 人、男性54 人；純合突變基因型ALDH2*2/*2個體共30 人，女性8 人、男性22 人。不同基因型人群的血尿酸如表1 所示。

表1 不同基因型人群的血尿酸(平均值±標準差)

2.3 野生基因型ALDH2＊1/＊1 人群的血尿酸分布

根據本醫院血尿酸的檢測方法，血尿酸的參考范圍：男性為208-428 μmol/L，女性為155-357 μmol/L。在此基礎上，野生基因型ALDH2*1/*1 人群的血尿酸分布如圖2 所示，血尿酸在正產范圍內的共0 人；血尿酸超出上限0～50 μmol/L 的共24 人，比例約為38.71%，血尿酸平均值為443.63±23.23 μmol/L；血尿酸超出上限50～100 μmol/L 的共15 人，比例約為24.19%，平均值為498.69±14.52 μmol/L；血尿酸超出上限100～150 μmol/L 的共10 人，比例約為16.13%，平均值為550.76±12.93 μmol/L；血尿酸超出上限150～200 μmol/L 的共7 人，比例約為11.29%，平均值為598.54±4.76 μmol/L；血尿酸超出上限200 μmol/L 的共6 人，比例約為9.7%，平均值為714.78±75.01 μmol/L。

圖2 野生基因型ALDH2＊1/＊1 人群的血尿酸分布

2.4 雜合基因型ALDH2＊2/＊1 人群的血尿酸分布

ALDH2*2/*1 人群的血尿酸分布如圖3 所示，血尿酸在正產范圍內的共0 人；血尿酸超出上限0～50 μmol/L 的共19 人，比例約為31.15%，血尿酸平均值為437.29±33.99 μmol/L；血尿酸超出上限50～100 μmol/L 的共22 人，比例約為36.07%，平均值為496.82±21.91 μmol/L；血尿酸超出上限100～150 μmol/L 的共13 人，比例約為21.31%，平均值為552.08±16.32 μmol/L；血尿酸超出上限150～200 μmol/L 的共4 人，比例約為6.56%，平均值為604.15±7.83 μmol/L；血尿酸超出上限200 μmol/L 的共3人，比例約為4.92%，平均值為636.97±4.34 μmol/L。

圖3 雜合基因型ALDH2＊2/＊1 人群的血尿酸分布

2.5 純合突變基因型ALDH2＊2/＊2 人群的血尿酸分布

ALDH2*2/*2 人群的血尿酸分布如圖4 所示，血尿酸在正產范圍內的共13 人，比例約為43.33%，血尿酸平均值為347.19±37.48 μmol/L；血尿酸超出上限0～50 μmol/L 的共7 人，比例約為23.33%，血尿酸平均值為427.46±28.44 μmol/L；血尿酸超出上限50～100 μmol/L 的共3 人，比例約為10.00%，平均值為459.63±24.25 μmol/L；血尿酸超出上限100～150 μmol/L 的共7 人，比例約為23.33%，平均值為508.51±24.18 μmol/L；血尿酸超出上限150 μmol/L 的共0 人。

圖4 純合突變基因型ALDH2＊2/＊2 人群的血尿酸分布

3 討論

在我們調查的153 名廣東人中，野生基因型ALDH2*1/*1共62 人，約占40.52%，雜合基因型ALDH2*2/*1 共61 人，約占39.87%，純合突變基因型ALDH2*2/*2 共30 人，約占19.61%。本研究納入的患者人數偏少，雖然不能表明當地人的ALDH2 基因多態性比例，但對于分析血尿酸與ALDH2 基因多態性的相關性的分析結果具有統計學意義。本研究顯示，野生基因型ALDH2*1/*1 與雜合基因型ALDH2*2/*1 的血尿酸差異并不顯著，尤其是在正常范圍內的血尿酸分布和血尿酸超出上限0～150 μmol/L 范圍內。僅在血尿酸超出參考值上限150～200 μmol/L 和200 μmol/L 以上范圍內，二者的血尿酸分布存在著較大的差異，兩種基因型在上述范圍內的占比分別為11.29%和9.7%、6.56%和4.92%。然而，純合突變型ALDH2*2/*2 的血尿酸分布與基因型ALDH2*1/*1 和ALDH2*2/*1 存在著顯著差異，其血尿酸平均值顯著較低。

除了上述ALDH2 基因變異造成的潛在飲酒量的差異外，基因型ALDH2*2/*1 與ALDH2*2/*2 的血尿酸分布的顯著差異，也充分體現了ALDH2 基因多態性與血尿酸關系的復雜性。在這方面已有多項研究被報道，Yamanaka 等[6]發現當攝入60mL 威士忌后雜合子ALDH2*1/*2 基因個體的血液和尿液的次黃嘌呤濃度明顯低于野生型ALDH2*1/*1 個體，而ALDH2*2/*2 個體的血液和尿液次黃嘌呤濃度并不升高；同時發現在痛風患者野生型ALDH2*1/*1 分布率要高于正常對照，而攜帶突變型ALDH2*2/*2 個體的痛風患者卻少于正常對照者，因此得出結論日本大部分痛風患者飲酒后無不適反應，可能更易形成飲酒的習慣，加劇痛風病情。Hashimoto[7]等的研究未發現ALDH2*2/*1、ALDH2*2/*2 基因型個體與ALDH2*1/*1 基因型個體血液尿酸濃度存在差異性。Sakiyama 等的研究發現野生型 ALDH2*1/*1 痛風發作風險顯著高于ALDH2*2/*1、ALDH2*2/*2 基因型人群[8]。Suwa研究團隊與Yamamoto 研究團隊均發現發現乙醇通過肝臟的氧化代謝過程，通過增加NADH/NAD 比值，加速丙酮酸向乳酸的轉化，從而使血液乳酸濃度升高競爭性抑制尿酸的排泄。同時，通過酒精代謝消耗ATP，加速腺嘌呤核苷酸的降解，從而導致AMP 的形成，從而增加尿酸的產生[9,10]。Yokoyama 等的研究發現，在日本人中ALDH2*1/*1 基因型對乙醇和乙醛的快速代謝和較高的酮癥水平與酗酒者較高的血尿酸水平有關[11]。

本研究表明，在一定的飲酒量的情況下，血尿酸與ALDH2 基因多態性存在著顯著的相關性，而基因型ALDH2*2/*2 和ALDH2*2/*1 人群的血尿酸分布的顯著差異，也說明二者的血尿酸與ALDH2 基因的相關性不僅與其活性相關，可能也與ALDH2 的其他功能相關，這一結果值得我們后續進一步深入研究。