DEHP短期暴露下的大鼠代謝酶及其代謝動態(tài)變化

黃卓權(quán)，劉瑞菁，黃少文，賀永健，劉煥，鄭冬冬，柳春紅*

（1.華農(nóng)（潮州）食品研究院有限公司，廣東 潮州 521000；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省食品質(zhì)量安全重點實驗室，廣州510642）

鄰苯二甲酸酯（Phthalate esters，PAEs）是一類用于增強產(chǎn)品穩(wěn)定性、耐久性等的化學(xué)增塑劑和工業(yè)溶劑，多用于聚氯乙烯管、食品包裝、醫(yī)療設(shè)備、兒童玩具、化妝品、黏合劑、殺蟲劑和護理產(chǎn)品中。隨著PAEs 廣泛用作增塑劑，其已成為遍布土壤、大氣、水體和生物體中的污染物[1-2]。鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯[Di-（2-ethylhexyl）phthalate，DEHP]是一種油性、低揮發(fā)性液體，在塑料制品中以非共價鍵的形式和高度疏水性維持自身的化學(xué)性質(zhì)，當(dāng)接觸到親脂性物質(zhì)時，便會從塑料制品中逸出，進入環(huán)境中[3]。研究表明，在空氣、水體、土壤、城市污水、肉類、蔬菜等中均有DEHP 檢出[4-5]，其最終會通過呼吸道、消化道和皮膚等途徑暴露于人群[1，4]。DEHP 作為毒性較大的一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，具有生殖毒性、免疫毒性、肝毒性及遺傳毒性等[6-8]。

研究表明，在人類和動物體內(nèi)，DEHP 會被腸腔中的胰脂肪酶迅速代謝為鄰苯二甲酸單（2-乙基己基）酯[Mono-（2-ethylhexyl）phthalate，MEHP][9]，體內(nèi)約67%的DEHP 以MEHP 的形式經(jīng)尿液排出體外，因此MEHP 可作為DEHP 暴露水平的生物標(biāo)志物[10]。肝臟是體內(nèi)重要的毒物代謝和轉(zhuǎn)運器官，肝臟Ⅱ相代謝酶可與外來化合物結(jié)合，進行生物轉(zhuǎn)化，降低化合物毒性，使外來化合物水溶性增加，便于排出體外。肝臟重要的Ⅱ相代謝酶有尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucuronosyl transferases，UGT），其催化的葡糖醛酸化是重要的肝臟Ⅱ相反應(yīng)機制之一，約占Ⅱ相新陳代謝的35%[11]。UGT 一共有4 種類型，分別是UGT1、UGT2、UGT3 和 UGT8，其中 UGT1 能有效利用葡萄糖醛酸使外來化合物糖基化，增加化合物水溶性，更易于外來化合物通過尿液等途徑排出體外[12]。此外，主要的肝臟Ⅱ相代謝酶還包括谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S-transferase，GST），GST 的主要作用有：催化各種親脂性、親電性代謝產(chǎn)物與還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）結(jié)合反應(yīng)生成親水性代謝產(chǎn)物，加快各種外來化學(xué)物及其代謝產(chǎn)物排出體外；還可以減少氧化應(yīng)激過程中產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物、膽固醇類過氧化物和脂肪酸類過氧化物，從而阻止氧化應(yīng)激對細(xì)胞的進一步損傷[13-15]。谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶pi（Glutathione S-transferase pi，GST-pi）是 GST 的一種亞型，可催化GSH 與化療藥物的結(jié)合，從而可以保護細(xì)胞免受化療藥物的損傷[16]。

本研究在分析DEHP 短期重復(fù)暴露對大鼠肝臟氧化指標(biāo)影響的基礎(chǔ)上，進一步探討DEHP 對肝臟Ⅱ相代謝酶的影響以及在血清、尿液中的代謝水平變化，研究結(jié)果不僅能豐富DEHP 的基礎(chǔ)毒性資料，也可為后續(xù)毒性機制、毒性干預(yù)等研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

DEHP 純度99.5%（美國Sigma-Aldrich 公司）；金龍魚玉米油（市售）；考馬斯亮藍(lán)試劑盒、MDA 試劑盒、SOD 試劑盒、GSH-Px 試劑盒（南京建成生物工程研究所）；大鼠 UGT1 試劑盒、GST 試劑盒、GST-pi 試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）；三羥甲基氨基甲烷（Tris）（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。配SPD-20A 檢測器的高效液相色譜儀LC-20A（日本島津公司）；Enspire Xenon Light Module多功能酶標(biāo)儀（美國Perkin Elmer公司）；Lynx 4000高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗動物與分組

32 只 SPF 級 Sprague Dawley 雄性大鼠，4～5 周，體質(zhì)量90～110 g，一批次購于廣東省醫(yī)學(xué)動物實驗中心，試驗動物合格證號：SCXK（粵）2013-0002。單籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后采用隨機區(qū)組設(shè)計分組法[17]按體質(zhì)量分為4 組，其中依據(jù)前人文獻(xiàn)報道和DEHP大鼠經(jīng)口急性毒性LD5（030.6 g·kg-1）設(shè)置低（300 mg·kg-1）、中（1 000 mg·kg-1）、高（3 000 mg·kg-1）劑量組[18]，另設(shè)對照組，每組8 只，低中高劑量組灌胃1 mL DEHP 玉米油溶液，對照組以等體積玉米油灌胃。飼養(yǎng)期間大鼠自由攝食、飲水，動物室溫度22～24 ℃，相對濕度45%～55%。按照大鼠的生活習(xí)性，每日上午9：00 灌胃，以經(jīng)口灌胃的染毒方式，連續(xù)灌胃28 d，每4 d 同一時間稱大鼠的體質(zhì)量及飼料消耗量，清洗水瓶并更換飲水，在第 7、14、21、28 d 上午 9：00 收集24 h 大鼠尿液。處死大鼠前禁食12 h，繼續(xù)保持自由飲水。末次染毒24 h 后，大鼠斷頸處死并迅速分離肝臟。

1.2.2 臟器系數(shù)

分離得到的32 份大鼠肝臟分別用預(yù)冷的生理鹽水沖洗，吸水紙吸干后稱質(zhì)量。臟器系數(shù)是臟器質(zhì)量與大鼠體質(zhì)量之比，計算公式如下：

臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量（g）/大鼠體質(zhì)量（g）×100%

1.2.3 血清制備

末次染毒24 h 后，32 只大鼠斷頸處死并迅速采血完畢，將采血管分別輕輕顛倒3～5 次，室溫（20～25 ℃）靜置 30 min 后，于 4 ℃、3 000 r·min-1離心 15 min，待測。

1.2.4 肝勻漿制備

以肝臟質(zhì)量∶體積=1∶9 的比例加入適量PBS 緩沖液，大鼠肝組織通過冷凍研磨儀進行勻漿，得到的勻漿液在4 ℃下2 000 r·min-1離心20 min，上清液即為10%肝勻漿。

1.2.5 大鼠肝微粒體的制備

取新鮮肝臟，用預(yù)冷的PBS緩沖液（0.01 mol·L-1）沖洗后，濾紙吸干，剪取1.5 g，按質(zhì)量∶體積=1∶4 的比例加入TMS 緩沖液（Tris 3.025 g，MgCl20.304 5 g，蔗糖 34.20 g，加蒸餾水溶解，HCl 調(diào)節(jié) pH 至 7.40，蒸餾水再定容至500 mL），用冷凍研磨儀制備成肝勻漿，4 ℃高速離心機12 000g離心20 min，小心吸取上清，按每毫升上清液加0.1 mL 88 mmol·L-1CaCl2溶液，輕輕攪拌數(shù)次，置冰浴中5 min，再將混合液于4 ℃高速離心機27 000g離心15 min，棄去上清，按每克肝組織所得微粒體沉淀重懸于5 mL 0.10 mol·L-1Tris溶液中（pH=7.40），用移液槍輕輕吹打，洗滌，除去雜蛋白和過量CaCl2，在4 ℃高速離心機27 000g離心15 min，所得沉淀為肝微粒體，上清液為肝胞液[8]。

32 只大鼠的肝勻漿、肝微粒體和肝胞液均采用考馬斯亮藍(lán)法定量總蛋白，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0.563 g prot·L-1，嚴(yán)格按照試劑盒說明書檢測SOD、GSHPx、MDA、UGT1、GST和GST-pi。

1.2.6 大鼠尿液和血清中MEHP含量的測定

將32 只大鼠的尿液分別置于10 mL EP 離心管中，13 000 r·min-1離心 5 min，取 1 mL 上清液放入新的10 mL 離心管中，加入 250 μL 醋酸銨溶液（1 mol·L-1，pH=6.5）和20 μL β-葡糖醛苷酸酶（200 U·mL-1），搖勻，超聲3 min，37 ℃水浴酶解90 min。酶解處理后的樣品中加入3 mL 乙酸乙酯，在旋渦振蕩器上充分振蕩后，以4 000 r·min-1離心5 min。吸取上層乙酸乙酯至10 mL 離心管中，重復(fù)萃取3 次。將萃取液合并后，45 ℃氮吹至近干，用乙腈復(fù)溶，0.22 μm 微孔濾膜過濾后上機[19]。

1.2.7 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 DEHP對大鼠體質(zhì)量的影響

28 d 染毒期內(nèi)各組大鼠體質(zhì)量均有所增長（圖1），3 000 mg·kg-1組體質(zhì)量在 12 d 后增速放緩，28 d時體質(zhì)量顯著低于其他各組。

2.2 DEHP對大鼠臟器系數(shù)的影響

各組大鼠肝臟臟器系數(shù)顯著升高（P＜0.05）（圖2），且呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。3 000 mg·kg-1組腎臟臟器系數(shù)極顯著高于其他各組（P＜0.01）。

2.3 DEHP對大鼠氧化系統(tǒng)的影響

2.3.1 血清中氧化指標(biāo)的檢測

300、1 000 mg·kg-1組的 SOD、GSH-Px 活力和MDA含量與對照組差異不顯著（P＞0.05）（表1），3 000 mg·kg-1組 SOD、GSH-Px 活力顯著降低，MDA 含量顯著升高（P＜0.05）。

2.3.2 肝臟中氧化指標(biāo)的檢測

肝臟各處理組SOD、GSH-Px 活力較對照組有下降趨勢（表2），3 000 mg·kg-1組顯著降低（P＜0.05）；3 000 mg·kg-1組MDA含量極顯著升高（P＜0.01）。

表1 大鼠血清中氧化指標(biāo)（，n=8）Table 1 Oxidation indices in rat serum（，n=8）

表1 大鼠血清中氧化指標(biāo)（，n=8）Table 1 Oxidation indices in rat serum（，n=8）

注：與對照組比較，*：P＜0.05；**：P＜0.01。下同。Note：Compared with the control group，*：P＜0.05；**：P＜0.01. The same below.

染毒濃度Exposure concentrations/（mg·kg-1）0 300 1 000 3 000 SOD/（U·mL-1）290±35 273±34 274±13 250±30*GSH-Px/（U·mL-1）2 180±224 2 030±297 2 080±168 1 900±229*MDA/（nmol·mL-1）6.54±1.14 6.52±1.89 7.07±1.74 7.45±2.17*

表2 大鼠肝臟中氧化指標(biāo)（，n=8）Table 2 Oxidation indices in rat liver（，n=8）

染毒濃度Exposure concentrations/（mg·kg-1）0 300 1 000 3 000 SOD（U·mg-1prot）1 750±371 1 630±302 1 560±321 1 450±633*GSH-Px/（μmol·g-1prot）690±139 681±78 614±114 606±151*MDA/（nmol·mg-1prot）1.76±0.29 2.18±0.60 2.00±0.29 2.42±0.49**

2.4 DEHP對肝微粒體中Ⅱ相酶UGT1、GST及GST-pi的影響

肝微粒體各處理組UGT1、GST-pi 含量較對照組呈升高趨勢（圖3），其中1 000、3 000 mg·kg-1組UGT1含量極顯著升高（P＜0.01）。與對照組相比，3 000 mg·kg-1組GST 含量極顯著升高（P＜0.01）。染毒各組GST-pi含量均顯著升高（P＜0.05）。

2.5 DEHP在體內(nèi)的代謝情況

2.5.1 血清中MEHP含量

血清各組MEHP含量隨染毒劑量加大而增加（圖4），對照組有微量檢出，1 000、3 000 mg·kg-1組MEHP含量較對照組極顯著升高（P＜0.01）。

2.5.2 尿液中MEHP含量變化趨勢

28 d 染毒期內(nèi)尿液各組MEHP 含量先升高（圖5），在第7 d 達(dá)到峰值，隨后逐漸降低，在第28 d 降到最低。在整個試驗周期內(nèi)，對照組尿液均有微量MEHP檢出。

3 討論

氧化應(yīng)激反映了機體活性物質(zhì)（包括活性氧和活性氮）產(chǎn)生和消除的不平衡，以及抗氧化劑產(chǎn)生的減少[20]。SOD 和GSH-Px 是體內(nèi)的主要抗氧化酶，它們可以通過清除自由基來保護細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的傷害。MDA 是細(xì)胞中多不飽和脂肪酸過氧化的最終產(chǎn)物之一，其過量產(chǎn)生與自由基的增加有關(guān)，因此該指標(biāo)可以反映機體組織內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度[21-22]。在本研究中，大鼠體質(zhì)量增長速度隨著DEHP 染毒劑量的增加而減緩，肝臟臟器系數(shù)卻顯著升高，與Li 等[23]的報道一致，說明DEHP 會造成肝臟損傷，影響動物生長。高劑量的DEHP 顯著降低大鼠血清和肝臟中SOD、GSH-Px 活力，增加MDA 含量（P＜0.05）。這與Luo 等[24]的研究結(jié)果相似，Nrf2 通路是細(xì)胞內(nèi)重要的調(diào)節(jié)氧化還原反應(yīng)的信號通路，可通過調(diào)節(jié)下游抗氧化酶的表達(dá)預(yù)防氧化應(yīng)激，然而高劑量DEHP 暴露會過表達(dá)Nrf2，導(dǎo)致Nrf2 的持續(xù)積累，抑制Nrf2 下游基因表達(dá)，阻斷了Nrf2 介導(dǎo)的氧化應(yīng)激防御反應(yīng)，從而提高ROS的含量。Nrf2下游基因表達(dá)被抑制，使抗氧化酶含量下降，ROS 的升高增加了MDA 的含量，引起大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致大鼠肝臟氧化損傷，并且染毒劑量越大，染毒時間越長，毒性作用越強，各項指標(biāo)差異越顯著，呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

Ⅱ相代謝酶UGT1 通過催化DEHP 代謝產(chǎn)物MEHP 在肝臟的葡萄糖醛酸化反應(yīng)，改變其官能團，增加MEHP 水溶性，使其便于從尿液等途徑排出體外[25-26]；GST、GST-pi 均為受 Nrf2 信號通路調(diào)節(jié)的靶基因[27]，其中GST 可通過親電性物質(zhì)改變成親水性物質(zhì)，不僅有利于化合物從尿液排出，還保護組織免受氧化應(yīng)激的損傷[13-15]；而GST-pi 是GST 的一類亞型，可保護細(xì)胞免受化療藥物的損傷[28]。在本研究中，隨著DEHP 染毒劑量的增加，大鼠肝臟的UGT1、GST、GST-pi 含量總體呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，在高劑量組中，UGT1、GST 和GST-pi 含量極顯著升高（P＜0.01）。這說明來自DEHP 的刺激誘導(dǎo)肝臟Ⅱ相代謝酶UGT1、GST、GST-pi 的合成增加，提升其含量，從而促進大鼠肝臟加強對DEHP 的解毒，使DEHP 更容易從大鼠體內(nèi)排出；GST含量的升高還意味著大鼠肝臟在抵抗DEHP 誘導(dǎo)發(fā)生的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減少肝臟的氧化損傷。

MEHP 是DEHP 在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，其毒性是DEHP 的10倍[29]，在肝臟經(jīng)過葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)后隨著尿液排出體外[26]。在本研究中，大鼠尿液中MEHP 含量在染毒第7 d時最高，并且染毒劑量越大，峰值越高，在第7 d之后，MEHP 含量降低。這可能是由于大鼠受到DEHP 的刺激后，肝臟開始應(yīng)激性調(diào)節(jié)，加強解毒作用，促使MEHP 經(jīng)過葡萄糖醛酸化反應(yīng)后通過尿液途徑排出體外；在DEHP 暴露28 d 后，大鼠血清中的MEHP含量隨染毒劑量加大而升高，且高劑量組的腎臟臟器系數(shù)極顯著高于對照組（P＜0.01），反映出隨著染毒時間的延長，肝臟雖然仍在代謝DEHP，生成代謝產(chǎn)物MEHP，但可能因為持續(xù)的染毒，導(dǎo)致腎臟排泄能力下降，使得肝臟代謝的MEHP蓄積在血液中，無法隨尿液排出體外，進而使后期大鼠尿液中MEHP 均有所減少。而本實驗對照組大鼠也被檢出少量MEHP，推測可能是因為對照組與各染毒組飼養(yǎng)在同一環(huán)境中，加上飲用水中也會有極微量DEHP[2]，導(dǎo)致對照組不可避免地攝入DEHP。

4 結(jié)論

（1）DEHP有致大鼠肝臟氧化損傷的毒性。

（2）DEHP 會誘導(dǎo)肝臟Ⅱ相代謝酶UGT1、GST 和GST-pi 含量升高，從而使得大鼠肝臟解毒作用反饋性增強。

（3）DEHP 的代謝產(chǎn)物MEHP 在尿液中的含量與DEHP 染毒劑量呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，且均在染毒第7 d時達(dá)到最高值。