畜禽糞污抗生素對土壤生物學效應的Meta分析

曾悅 ，黃紅英 ，吳華山 *

（1.南京師范大學環境學院，南京 210042；2.江蘇省農業科學院農業資源與環境研究所，南京 210014；3.農業農村部種養結合重點實驗室，南京 210014；4.江蘇省有機固體廢棄物資源化協同創新中心，南京 210014）

畜禽養殖廢棄物資源化利用是治理養殖污染的重要手段，但畜禽糞便中獸用抗生素殘留問題，一直是近年來研究的熱點。隨著養殖業規模化發展加速，抗生素的使用量也在快速增加，尤其在缺少有效監管的情況下，還存在抗生素濫用的行為。據估計，近年來我國抗生素的使用量已超16.2 萬t[1]。全球每年抗生素總使用量的70%用于養殖業[2]。然而抗生素進入動物體后，只能被吸收利用一小部分，30%～90%的抗生素會隨著畜禽糞便排出[3]。氟喹諾酮類、磺胺類和四環素類是在畜禽糞便中最常檢測到的抗生素[4-8]，且其殘留濃度范圍廣泛，抗生素的最高檢出濃度通常出現在糞便處理區附近的農田或者長期施用糞肥澆灌的農田[9]。抗生素殘留問題給農村生態環境帶來較大的潛在風險，甚至最終影響人體健康。

近年來，國內外學者對抗生素在土壤中的殘留、降解、生態毒性和風險評價等已有了大量研究。張慧敏等[10]通過對浙北地區土壤及畜禽糞便中的四環素類抗生素的殘留研究發現，施用畜禽糞肥的農田表層土壤土霉素、四環素和金霉素的平均含量分別為未施畜禽糞肥農田的38、13倍和12倍，畜禽糞肥是農田土壤抗生素的重要來源。張濤等[11]提出，土壤及抗生素本身的性質會對抗生素在土壤中的殘留濃度產生影響，耕地較容易積累抗生素。劉吉強等[12]研究了油菜田中四環素對土壤酶活性的影響，結果發現四環素對土壤蛋白酶、脲酶、轉化酶、過氧化氫酶的活性具有階段性的抑制、激活作用，且在低濃度條件下，具有短暫的激活效果。Grenni 等[13]的研究指出，抗生素在土壤中的遷移轉化與土壤性質有較大關聯，四環素在壤土中的吸附能力是沙土中的3 倍，在黏土中可能更高；在土壤環境中，各種抗生素可能會發生相互作用，進而影響抗生素的降解。Yan 等[14]通過向土壤中分別添加含不同濃度強力霉素的豬糞，探究土壤中的微生物降解行為，結果發現土壤中強力霉素的降解速率受其在土壤中初始濃度的影響，微生物可以顯著加速強力霉素的降解，微生物降解是強力霉素土壤降解的主要方式。Liu 等[15]的研究表明，土壤受到抗生素污染時，磺胺甲惡唑對土壤微生物群落的影響比金霉素更強，但隨著抗生素的降解，土壤微生物群落功能可以逐步恢復，且在此過程中，磺胺甲惡唑的降解相對較快。

雖然目前有眾多關于養殖糞便抗生素殘留影響的研究，但幾乎都是選擇某個特定試驗點進行分析，受到試驗點的生物地理環境因素影響，其結果有較大差異，也給畜禽糞污資源化利用的安全性帶來不確定性。

本研究通過對已發表文獻中的數據進行收集，運用Meta 分析，統計文獻中主要抗生素：四環素類、磺胺類、氟喹諾酮類在土壤中的降解情況，獲得土壤中此3 類抗生素的降解能力、降解時間，及不同濃度下對土壤微生物多樣性的影響，分析得出現有研究的主要結果和趨勢，以期評價養殖糞污從產出到用于農田的安全性，為養殖糞污資源化利用提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 數據來源及選擇標準

養殖糞污中抗生素種類包括了大環內酯類、氨基糖苷類、內酰胺類、磺胺類、四環素類、氟喹諾酮類6類，選用目前研究較多的3 種主要獸用抗生素：四環素類（土霉素、金霉素、四環素）、磺胺類（磺胺二甲嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺嘧啶）和氟喹諾酮類（環丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星）為統計對象。通過CNKI中國知網和Web of Science 數據庫，以“抗生素、土壤、四環素、磺胺、氟喹諾酮、殘留、降解、微生物”等作為關鍵詞進行檢索，選取2000—2019 年間在CNKI 以及Web of Science上發表的文獻。

文獻篩選標準為：（1）文獻至少研究一種目標抗生素從養殖糞污進入土壤后的降解情況；（2）實驗必須包含嚴格的對照組和處理組；（3）每單個實驗的重復數至少3 次；（4）文獻中的數據必須包含均值及樣本數；（5）土壤樣本取自0～20 cm 淺層土壤；（6）關于微生物多樣性的文獻需要包含微生物多樣性的香農指數。

1.2 數據收集及分類

收集的數據包括：土壤中添加抗生素前后的香農指數、土壤中抗生素的降解率、抗生素在土壤中處理一段時間前后的含量，抗生素含量的單位統一為mg·kg-1。此外，文獻中注明的試驗點位置、土壤類型、pH 等信息也收集，若文獻中數據用圖表示，則使用GetData Digitizer 2.24 軟件獲取。最終從數據庫中獲得有效文獻59 篇，其中英文文獻39 篇，中文文獻20篇，最終獲得有效數據463組。主要指標確定如下：

（1）抗生素降解速率指標：由于抗生素在土壤中7 d 后，其殘留會表現出急劇下降的趨勢[16-17]，且大多數實驗進行到30 d 左右抗生素降解趨于平緩[18-19]，因此將抗生素在土壤中的降解速率劃分為≤7 d、7～30 d、＞30 d進行討論。

（2）土壤殘留抗生素初始濃度指標：按抗生素不同初始濃度分為≤10 mg·kg-1（低濃度）、10～100 mg·kg-1（中濃度）、＞100 mg·kg-1（高濃度）。

（3）土壤類型指標：土壤類型按照《中國土壤分類與代碼》（GB/T 17296—2009）分為12 類，選取的研究樣本包括6 類，即鐵鋁土（磚紅壤、赤紅壤、紅砂壤），淋溶土（棕壤、暗棕壤），半淋溶土（黑土、塿土），初育土（紅黏土），半水成土（潮土、灰潮土），人為土（水稻土）。

（4）酸堿指標：樣本pH 范圍為4.3～9.4，分為弱酸性（pH 4.3～6）、中性（pH 6～8）、弱堿性（pH 8～9.5）。

1.3 Meta分析

選擇“Response ratio”指標作為本研究處理與對照之間的效應值（RR），由公式（1）進行計算：

式中：lnRR為處理與對照之間的效應值，無單位；Xt和Xc分別為處理組和對照組的平均值，無單位。抗生素在土壤中降解情況的研究中處理組為經過土壤降解后的抗生素濃度，對照組為土壤降解前的抗生素濃度；抗生素對土壤微生物多樣性的影響中處理組為抗生素在土壤中存留一段時間后的微生物多樣性指數，對照組為抗生素流入前的土壤微生物多樣性指數。

方差（1/V）的倒數由式（2）計算：

式中：V為均值變異系數，無單位；St、Sc和Nt、Nc分別代表處理組、對照組的標準差和處理組、對照組的重復數。為了得出處理組相對于對照組的總體反應效果，將處理與對照效應值均值進行加權處理，最后數據分析基于加權效應值及加權效應值的95%置信區間（95%CI）。

使用反變換（elnRR-1)×100%來反映抗生素的降解率以及抗生素對土壤微生物多樣性的影響。

研究采用MetaWin 2.1軟件，選擇隨機效應模型，計算每一組數據的效應值和95%CI。當效應值的95%CI 小于0 時，認為農田中抗生素的降解效果顯著或是抗生素對土壤微生物多樣性具有顯著抑制作用（P＜0.05），當效應值的95%CI 大于0，認為抗生素對土壤微生物多樣性具有顯著促進作用，若95%CI包含0，則認為處理不顯著[20]。

1.4 數據處理

通過Meta 方法獲得處理與對照之間的加權效應值，以此分析抗生素降解率以及對土壤微生物功能多樣性的影響程度，SPSS 用于最小顯著差異化檢驗，Origin 2018軟件用于繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同種類抗生素的降解率

分析并比較養殖糞污中3 類主要抗生素（四環素類、磺胺類、氟喹諾酮類）在土壤中的降解速率，文獻調研共獲得有效數據330 組，利用Meta 進行統計，結果見圖1。根據Meta 分析結果，抗生素在前7 d 降解迅速，之后會逐步放緩直至趨于穩定。從降解速率上看，磺胺類抗生素降解最快，降解率在第7 d 達到66%，＞30 d 時達到91%，在所有抗生素中最高；四環素類抗生素的降解速率略低于磺胺類，降解率在第7 d 達到62%，＞30 d 時達到85%；氟喹諾酮類在土壤中降解比較緩慢，7～30 d僅降解48%。

2.2 抗生素不同初始濃度、pH 及土壤類型對土壤抗生素降解率的影響

研究3種抗生素在土壤中低、中、高3種不同初始濃度條件下前7 d 的降解率，共有數據241 組。統計結果見圖2。根據統計，3種抗生素均表現出當土壤中抗生素初始濃度在中濃度時，前7 d的降解率最高，低濃度時其次，高濃度時最小。但磺胺類3 種濃度差異表現不顯著；氟喹諾酮類中濃度和高濃度有顯著差異，其他差異不顯著；四環素類中濃度顯著高于其他兩種濃度，高、低兩種濃度差異不顯著。總體上說明，過高或過低濃度的抗生素在土壤中的降解率都會下降，但不同抗生素種類具有差異。

由于土壤特性對抗生素降解也有一定影響，因此將pH和土壤類型與抗生素30 d內降解率進行單因素方差分析，以此探究土壤條件因素對抗生素降解的影響。文獻調研共獲得文獻40 篇，數據351 組，結果如表1和表2所示。

表1 pH對抗生素降解率的影響Table 1 Influence of pH on antibiotic degradation rate

從表1 可以看出，不同的土壤pH 對土壤抗生素降解具有顯著的影響，偏酸性土壤更有利于土壤中抗生素的降解。從表2 可以看出，半水成土及半淋溶土中抗生素的降解率在85%以上，且顯著高于其他土壤類型中的降解率，其他土壤類型中抗生素降解率不具有顯著差異，這可能主要是因為土壤酸堿度的影響，從樣本pH 范圍來看，半淋溶土與半水成土的pH范圍都是弱酸性。

2.3 抗生素對土壤微生物功能多樣性的影響

抗生素對微生物功能多樣性的影響主要受抗生素種類、濃度的影響，為了探究抗生素濃度對微生物多樣性的影響，基于文獻調研數據，以土壤中抗生素低、中、高3 種不同初始濃度為指標，獲得不同濃度下抗生素對土壤微生物功能多樣性的影響，共獲得數據112 組。結果如圖3 所示。從圖3 可以看出，氟喹諾酮類和四環素類抗生素在土壤低濃度時并沒有對微生物功能多樣性有抑制作用，反而具有微弱的促進作用，但濃度大于10 mg·kg-1時，兩種抗生素對土壤中微生物多樣性均表現出抑制作用，且氟喹諾酮類的抑制作用更顯著，當達到中濃度時，就已經表現出顯著的抑制作用；四環素類抗生素雖然在中、高濃度對于土壤中抗生素具有一定抑制作用，但總體上其影響效果遠不如其他兩種抗生素顯著，不同濃度之間差異也不顯著。磺胺類抗生素在3 個濃度組中均表現出抑制效果，濃度越大，對土壤微生物多樣性抑制作用越大，當濃度≥100 mg·kg-1后，其抑制作用表現尤為顯著。總體上，抗生素濃度越高，對土壤微生物功能多樣性抑制作用越大，3 種抗生素中四環素類抗生素抑制作用最小，中濃度時氟喹諾酮類影響最大，到高濃度時，磺胺類影響最大。

表2 土壤類型對抗生素降解率的影響Table 2 Influence of soil type on antibiotic degradation rate

將抗生素對微生物功能多樣性的影響與抗生素在土壤中的初始濃度、殘留時間、抗生素降解以及土壤pH 作Pearson 相關性分析，結果如表3 所示。抗生素對微生物功能多樣性的影響與抗生素在土壤中的殘留時間在0.01 水平下具有顯著負相關；與土壤pH在0.05水平下具有顯著正相關；與抗生素降解在0.05水平下具有顯著負相關。隨著抗生素在土壤中降解，抗生素對微生物功能多樣性的影響逐漸減小，而土壤pH 越高，抗生素對土壤微生物功能多樣性的影響程度越高。

3 討論

3.1 土壤中抗生素降解的影響因素

土壤中抗生素降解與多種因素相關，受土壤生物地理環境影響，抗生素之間降解差異明顯。抗生素在土壤中的降解率從大到小依次為磺胺類＞四環素類＞氟喹諾酮類。磺胺類抗生素易降解，7 d 降解率能達到66%，而氟喹諾酮類較難降解。這與現有的一些研究結果相符，Alexy等[21]模擬了18種抗生素的降解，結果表明金霉素等抗生素被完全降解，而氧氟沙星的降解率僅為7.5%；Cycon 等[22]的研究同樣顯示，氟喹諾酮類抗生素的降解周期長于磺胺類、四環素類抗生素。磺胺類抗生素易降解的特性可能與磺胺類化合物易與土壤成分牢固結合形成穩定殘基有關[23-24]；Mohring 等[25]研究認為，磺胺嘧啶在土壤中處理40 d后幾乎完全被降解，屬于極易降解抗生素。一般而言，抗生素在土壤中的降解隨抗生素初始濃度的增加而增加[26]，但抗生素初始濃度過高，也會反過來影響抗生素在土壤中的降解率[27]。在本研究中，四環素類抗生素降解速率受初始濃度的影響極顯著（低濃度組與中濃度組P＜0.01、中濃度組與高濃度組P＜0.001），氟喹諾酮類抗生素在中、高初始濃度組間同樣具有顯著差異（P＜0.001），但磺胺類抗生素降解率幾乎不受初始濃度影響。張紫琴等[28]對青霉素G 鉀在蔬菜地土壤中的降解動力學進行研究，認為初始濃度越高，降解速率越快，但其不會被完全降解，土壤中仍然會有少量青霉素G 鉀存在。此前已有學者指出，土壤pH 是影響抗生素降解的環境主控因素。丁韶鑫等[29]對影響磺胺甲惡唑降解的因素進行了研究，結果表明降低pH 有利于磺胺甲惡唑降解；Chen 等[30]的研究認為，pH 過高或過低都會導致環境中與抗生素降解相關的活性分子含量降低，繼而影響抗生素降解速率；李偉明等[31]研究發現，四環素類抗生素在pH 約為6.5和溫度為25 ℃的條件下微生物組活性更高，降解率更高。本研究中弱酸性土壤條件更有利于抗生素降解，弱酸性土壤中抗生素降解率達到82%，且與弱堿性土壤條件具有顯著差異（P＜0.05）。土壤類型同樣是影響抗生素降解的一大重要因素，半淋溶土及半水成土中抗生素降解率顯著高于其他土壤類型（P＜0.05）。許靜等[32]運用室內模擬降解法，研究了5種磺胺類抗生素在不同類型土壤中的降解能力，結果顯示磺胺類抗生素在黑土中的降解能力最強，在紅壤中的降解能力最弱。Koba等[33]運用主成分分析法，分析抗生素降解的主要影響因素，結果顯示土壤類型與抗生素降解高度相關。土壤類型對抗生素降解的影響可能與土壤pH 有關，半淋溶土及半水成土中的抗生素降解率更高，同時半淋溶土與半水成土的樣本pH 都為弱酸性。

表3 抗生素對土壤微生物功能多樣性的影響與抗生素初始濃度、殘留時間、降解以及土壤pH的相關性分析Table 3 Effects of antibiotics on soil microbial diversity correlated with antibiotic species，initial concentration，residual time，soil pH and soil type

3.2 抗生素殘留對土壤微生物多樣性的影響

抗生素種類、濃度以及在土壤中的殘留時間對土壤微生物多樣性的影響較大。本研究中不同種類抗生素對土壤微生物的多樣性均具有顯著抑制作用，抑制能力依次為磺胺類＞氟喹諾酮類＞四環素類，磺胺類抗生素即使在低濃度條件下對微生物多樣性影響也表現為抑制作用，Schmitt等[34]認為磺胺類抗生素會抑制細菌細胞生長，因此導致土壤微生物多樣性的減少。氟喹諾酮類及四環素類抗生素對微生物多樣性同樣表現出抑制效果，但在低濃度條件下則能促進微生物多樣性增加，這種現象的原因可能是土壤微生物將抗生素利用為生長養分[35]，且抗生素重復施用也可能導致細菌適應性增強，從而促使抗生素抗性微生物增殖[3]。在本研究中，抗生素對土壤微生物多樣性的影響與抗生素在土壤中的降解具有相同的趨勢[36]。抗生素對土壤微生物功能多樣性影響的效應值（RR）與抗生素降解的效應值（RR）具有顯著負相關（P＜0.05），抗生素在土壤中的殘留時間超過30 d 后，對土壤微生物多樣性的抑制遠低于抗生素剛進入土壤的前7 d，土壤微生物多樣性與抗生素降解具有密不可分的聯系。Liu 等[37]研究發現，土壤微生物功能多樣性對環丙沙星在土壤中的降解有較大影響。Halling等[38]研究了磺胺二甲嘧啶在土壤中的降解及其對土壤微生物多樣性的影響，結果同樣顯示，抗生素在土壤中的快速消散在抗生素對土壤微生物群落的影響方面具有一定作用。土壤自身理化性質對微生物功能多樣性同樣會有影響，本研究中土壤pH 與微生物功能多樣性具有顯著正相關。王楠等[39]通過模擬酸雨條件探究了土壤理化性質與土壤微生物之間的關系，相關分析結果表明，土壤pH、速效鉀等土壤理化性質與土壤微生物群落結構密切相關。黃冠南等[40]的研究結果同樣說明微生物群落結構與土壤性質具有一定關聯。此外，土壤pH 還可能通過影響抗生素的降解，間接影響抗生素對土壤微生物多樣性的抑制程度，且抗生素通過養殖糞污還田的方式進入土壤，與糞肥中其他有機化合物聯用，其土壤降解、對微生物多樣性的影響與抗生素單一施用于土壤有一定差異，可能會導致抗生素降解速率以及對微生物多樣性影響的變化。

4 結論

（1）根據文獻統計研究，3 類抗生素在土壤中初期降解最快，30 d 后逐漸趨于平緩，抗生素最終降解率為77%～91%。3 類抗生素的降解速率和30 d 降解率從大到小依次為磺胺類＞四環素類＞氟喹諾酮類。

（2）初始濃度對抗生素降解率具有一定影響。當土壤中抗生素初始濃度在中濃度（10～100 mg·kg-1）時，前7 d 的降解率最高，低濃度（≤10 mg·kg-1）時其次，高濃度（≥100 mg·kg-1）時最小。土壤類型、pH 會顯著影響抗生素的降解率，弱酸性土壤環境更有利于抗生素降解；半水成土及半淋溶土中抗生素降解率高于85%，顯著高于其他土壤類型。

（3）土壤中四環素類和氟喹諾酮類抗生素濃度≤10 mg·kg-1時，對土壤微生物功能多樣性具有微弱的促進作用，＞10 mg·kg-1時為抑制作用；磺胺類抗生素在任何初始濃度條件下均表現出抑制效果。抗生素初始濃度越高對土壤微生物功能多樣性的抑制作用越大，總體上四環素類抗生素抑制作用最小，中濃度時氟喹諾酮類影響最大，高濃度時磺胺類影響最大。

（4）相關分析結果表明，抗生素在土壤中的存留時間越長對土壤微生物多樣性的影響越弱；而土壤pH在4.3～9.4的范圍內時，pH越高抗生素對土壤微生物多樣性的影響越強；隨著抗生素的降解，抗生素對土壤微生物多樣性的影響程度逐漸降低；抗生素對土壤微生物功能多樣性的影響與抗生素的初始濃度幾乎沒有關聯。