微生物固定化生物炭對水體銨態氮去除效果的研究

吳夢莉，李潔*，智燕彩，2，李剛，賴欣，居學海，張貴龍*

（1.農業農村部環境保護科研監測所，天津 300191；2.江南大學環境與土木工程學院環境過程與污染控制研究所，江蘇 無錫 214122；3.農業農村部農業生態與資源保護總站，北京 100125）

目前用于固定微生物的方法包括吸附法、包埋法、共價法和交聯法[5]，其中共價法與交聯法反應相似，是靠化學結合的方法使細胞固定化，其反應激烈、操作復雜、條件不易控制，所以應用較少。吸附法是將生物炭和細菌菌液混合，利用生物炭的吸附作用以及微生物掛膜使細菌定殖在生物炭上[6]；包埋法是將生物炭和細菌菌液簡單混合，利用化學溶劑作為包埋材料將混合后的生物炭與菌體固定在包埋材料內部形成固定化小球[7-8]。與共價法和交聯法相比，吸附法和包埋法技術成熟、操作簡便且對微生物影響小，故應用廣泛[9-10]。常用的固定載體材料包括生物炭[11]、浮石、黏土礦物及高分子材料等[12-15]。其中，生物炭是高溫厭氧熱解產生的一類富碳物質，其孔隙豐富、比表面積大、穩定性強，能為微生物提供碳、氮源及棲息場所[16]，是一類較有前景的載體材料。前期研究發現，利用蘆葦生物炭吸附固定活性污泥處理污水中的時，生物炭能夠較好地固定優勢菌群，72 h 時去除率達到96.3%[17]。利用稻殼生物炭固定硝化菌劑對水體去除率可達85%，遠超過單一稻殼生物炭30%的最大吸附效率[18]；以秸稈生物炭為載體固定黃假單胞菌處理濕地低溫污水去除率達到95%[19]。因此，生物炭固定具有脫氮功能的菌體，可提升其對水體的去除效果。

近年研究顯示，花生殼生物炭平均孔徑較大且為多孔隙結構，其組成與結構利于速效養分和細菌等微生物吸附固定[20-21]。此外，我國是世界上花生生產和出口量最大的國家，將占總產量三分之一的花生殼等廢棄原料進行炭化處理，具有顯著的開發利用價值和重要的生態意義[22]。但不同菌種表面結構、存活條件不同，花生殼生物炭固定新型脫氮菌對水體的吸附性能及效果仍有待進一步探索。本研究以花生殼生物炭為載體，比較吸附法和包埋法分別固定pd01 脫氮副球菌（Paracoccus denitrificans）、假單胞菌d4-1（Pseudomonas）和拉烏爾菌（Raoultella）的微生物顆粒對模擬廢水中的去除效果，以期探索高效的廢水凈化方法，同時為炭基載體材料的開發應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 生物炭的制備

將花生殼用清水洗凈表面塵土、烘干，粉碎并過2 mm 篩，然后放入馬弗爐內，通入N2，以5 ℃·min-1的速率升溫至600 ℃熱解2 h，冷卻后取出。加入去離子水，用磁力攪拌器攪拌30 min，靜置30 min，用抽吸泵濾出生物炭，并加入1 mol·L-1鹽酸浸泡1 h，去除生物炭中灰分[23]。再用去離子水將生物炭洗至中性，烘干后儲存于密封玻璃瓶內備用。生物炭組分和基本理化性質見表1。

1.2 細菌來源及培養基

所用菌種均由中國科學院上海高等研究院篩選并提供，3 株細菌均為異養硝化-好氧反硝化菌，分別是pd01 脫氮副球菌（Paracoccus denitrificans，T）、假單胞菌 d4-1（Pseudomonas，J）和拉烏爾菌（Raoultella，L），掃描形態見圖1。

供試菌株生長培養基：葡萄糖5 g·L-1、蛋白胨12g·L-1、酵母提取物24 g·L-1、無水 KH2PO42.31 g·L-1、K2HPO4·12H2O 16.43 g·L-1，調節pH 為7.0～7.3，115 ℃滅菌20 min。固體培養基再加入20 g·L-1瓊脂。

表1 生物炭組分和基本理化性質Table 1 Biochar components and basic physicochemical properties

1.3 生物炭固定菌株的制備

從-70 ℃環境取出甘油保存的菌種，融化后取100 μL菌液，稀釋107倍后涂布于固體生長培養基中，放入30 ℃恒溫培養箱培養24 h。待細菌長出后，挑取單菌落于液體培養基，在30 ℃、200 r·min-1的搖床內培養至OD600=1.0±0.2，將菌液離心得到菌體，用無菌水將菌體洗滌3 次，最后加入原體積濃度為0.85%的生理鹽水重懸，4 ℃保存備用。為保證細菌活性，試驗在48 h內完成。

吸附固定：按10 mL 菌液加入1 g 生物炭的比例將花生殼生物炭和菌液混合，然后在25 ℃、200 r·min-1搖床吸附18 h，并于4 ℃環境下保存，制得吸附菌株生物炭。

包埋固定：包埋劑材料為10%聚乙烯醇（PVA）和2%海藻酸鈉（SA）的混合溶劑，其中PVA 為主要包埋材料，SA 為添加劑，二者混合的體積比為7∶3[24]，交聯劑為2%的飽和硼酸-CaCl2溶液，用Na2CO3調節pH至6.7。按生物炭與菌液1∶10 的比例取相應量的菌液，離心后加入約原菌液體積1/3的0.85%生理鹽水將菌體重懸并與生物炭混合。混合后的生物炭-菌液置于搖床中200 r·min-1，30 ℃吸附2 h 后再加入約原菌液2/3 體積的SA-PVA 混合物與其充分混勻，用3#注射器將混合后的物質逐滴滴入飽和硼酸-CaCl2中，在4 ℃環境下交聯18 h，過濾并用無菌水洗滌3 次，制得包埋細菌生物炭小球[25-26]。

分別取生物炭（BC）、吸附菌株生物炭（XF-BCT/J/L）、包埋菌株生物炭（BM-BC-T/J/L）加入到體積為100 mL 的模擬廢水中，同時設不加任何物質（Blank）、單加菌株（T/J/L）、單加包埋材料（BM）、加生物炭與包埋材料復合體（BM-BC）為對照，為盡量保證加入模擬廢水中物質的量相同，處理中生物炭、細菌、包埋劑的量均保持一致。將所有處理置于30 ℃恒溫培養箱中培養，每日搖晃1次。分別于1、3、7、15、30 d 取培養后的模擬廢水離心測定溶液中濃度，并利用下列公式計算去除率：

1.5 測定與分析方法

2 結果與分析

2.1 微生物固定化生物炭的表面結構特征

由掃描電鏡圖（圖2）可以看出，BC呈蜂窩狀孔隙結構，表面除零星分布一些細碎顆粒外，較為干凈平整；而BM-BC 表面孔隙結構被覆蓋，表面呈褶皺狀。從電鏡圖可以明顯看到T、J 和L 菌分別以餅狀、桿狀與粒狀形態分布于生物炭表面，這說明通過吸附和包埋兩種方法，均能將3 種菌株加載到生物炭表面，但不同方法細菌附著位置有所不同。吸附法固定脫氮副球菌、假單胞菌和拉烏爾菌（XF-BC-T、XF-BC-J、XF-BC-L）時，細菌主要附著在生物炭孔隙、溝壑、粗糙結構處。包埋法固定3 種菌株時，細菌被包埋劑包裹與生物炭合為一體，其中BM-BC-L 最為明顯。此外，在包埋過程中，生物炭的孔隙結構會被包埋劑等填充、遮蓋，中孔和大孔結構因此減少。

2.2 微生物固定化生物炭的比表面積及孔隙結構特征

兩種微生物固定方法均顯著影響生物炭的比表面積及孔隙結構（表2）。與BC 相比，XF-BC-T 使生物炭微孔容積（VHK）、介孔容積（VDFT）和大孔容積（VBJH）分別縮小13.5%、19.5%和25.8%，比表面積縮小 17.2%。而 XF-BC-J 主要降低 VHK和 VBJH，VHK和VBJH分別減小5.4%和9.4%，VDFT縮小1.2%，比表面積縮小5.5%。XF-BC-L 處理比表面積增至269.54 m2·g-1，增幅達45%，VHK增加43%，但是VDFT和VBJH分別縮小36.6%和22.6%。

表2 固定菌株生物炭比表面積和孔隙結構特征參數Table 2 Specific surface area（SSA）and pore structure parameters of biochar under different treatments

包埋法固定3 種微生物均縮小了生物炭的比表面積，減小 VHK、VDFT、VBJH（表 2）。與 BC 相比，BMBC-T、BM-BC-J、BM-BC-L 的比表面積分別縮小87.3%、91.4%和96.3%；VDFT分別縮小84.1%、90.9%、98.2%，VBJH縮小 70.1%、88.3%、89.1%。包埋處理下，生物炭微孔幾乎被全部封堵。

2.3 微生物固定化生物炭的遠紅外光譜特征（FT-IR）

吸附和包埋法固定3種微生物生物炭的紅外光譜如圖3所示。BC的特征峰主要包括3 406.40、2 923.20、1 586.79、1 094.27 cm-1，分別為羥基（—OH）、亞甲基（—CH2—）、羰基（C=O）、醚鍵（—C—O—C—）的伸縮振動峰。

BM-BC-T、BM-BC-J、BM-BC-L 在 3 228.05、2 923.20、1 586.79、753.97 cm-1處的特征峰均有所加強，并呈現不同程度的偏移（圖3b），并于2 260、1 714、1 427、1 138、663 cm-1附近出現新峰，分別表征B—H伸縮振動、芳香酸酯C=O伸縮振動、雙鍵或羰基相連的—CH2、C—O 伸縮振動峰以及 C—H 面外彎曲振動。而XF-BC-T、XF-BC-J、XF-BC-L 與BC 相比，特征峰未發生顯著變化，說明僅微生物附著不會影響生物炭表面官能團的結構和組成。

2.4 微生物固定化生物炭對水體去除的作用

3 討論

根據前期報道，加載菌體和包埋劑通過孔隙填充、表面駐留及遮掩等改變生物炭孔徑和比表面積。本研究中，XF-BC-T 和XF-BC-J 均減小生物炭表面孔隙（微孔、介孔和大孔）和比表面積，這與Qi 等[8]的研究一致，原因在于該類微生物更易附著于生物炭表面溝壑和孔隙結構處，從而減小孔隙體積和比表面積。與BC 相比，XF-BC-L 具有更大的微孔體積和比表面積，這可能是因為拉烏爾菌本身比表面積較大，更易分布于生物炭表面和較大孔隙結構中，在減小介孔和大孔孔隙度的同時，亦會因為菌體較大相互擁擠而產生微孔結構[7]。結合表2 發現，雖然XF-BC-L 中生物炭微孔和比表面積增加，但的去除率并沒有提高，說明由吸附拉烏爾菌引起的生物炭微孔和表面積的改變對水中去除效果沒有顯著影響。這與Taghizadeh 等[31]的研究一致，去除水中時，生物炭的化學吸附比物理吸附效果更顯著。

Li 等[27]利用共聚物水凝膠去除廢水中重金屬離子的研究表明，凝膠多孔結構在離子吸附過程中主要通過官能團提供吸附位點。本研究利用親水性包埋材料固定微生物，包埋固定法制備的生物炭除了含有大量的—OH、—CH2、羰基C=O 等官能團外，還引入了C—H、—CH2、B—H、C—O 和芳香酸酯 C=O 等新官能團，這主要由包埋材料帶入，前期研究表明海藻酸鈉、聚乙烯醇以及交聯劑硼酸中均帶有上述基團[32-33]。同時生物炭表面含有的—OH、—C=O 等官能團，可通過形成氫鍵、氧化還原反應以及離子電荷等作用吸附溶液中的N[34-35]，因此生物炭自身也表現出較高的去除能力。

表3 不同處理對銨態氮（NH+4-N）的去除率（%）Table 3 Removal rates of ammonium nitrogen（NH+4-N）under different treatments（%）處理Treatments BC BM TJL XF-BC-T XF-BC-J XF-BC-L BM-BC BM-BC-T BM-BC-J BM-BC-L 1 d 8.4±2.1f 17.5±0.8b 14.2±1.1c 19.5±1.0b 13.5±1.0cd 10.5±1.3def 12.2±1.7cde 9.5±0.4ef 18.6±1.5b 20.7±1.2b 24.6±0.7a 19.7±1.3b 3 d 42.6±0.5a-1.4±2.5e 36.2±1.9b 44.7±0.9a 35.0±1.5bc 19.0±1.6d 32.5±0.5bc 30.1±1.7c 17.0±1.3d 21.7±0.5d 18.3±1.5d 17.2±1.4d 7 d 74.3±1.1b-21.6±1.0g 90.5±3.9a 95.9±1.3a 91.2±1.2a 57.7±1.8c 60.1±1.5c 64.0±1.8bc 1.0±0.7f 26.7±1.3d 19.1±0.8de 14.4±0.7e 15 d 94.5±2.2a 21.8±0.7d 96.1±＜0.1a 96.0±0.1a 96.0±0.1a 89.7±0.3a 90.1±0.6a 72.0±1.2b 55.3±0.9c 74.1±0.5b 74.2±1.1b 68.5±1.6b 30 d 95.9±1.7bc 26.0±1.7e 97.0±0.1ab 80.1±1.1d 96.4±1.9bc 98.5±0.2ab 99.1±0.0a 97.9±0.9a 94.2±1.1c 96.9±0.3ab 97.3±0.7a 96.8±0.2ab注：同列不同小寫字母表示不同處理間差異顯著（P＜0.05）。Note：The different lowercase letters in a column indicate significant differences among treatments at 0.05 levels.

本研究制備的固定微生物生物炭可改變孔隙結構和比表面積，引入更多官能團，影響生物炭凈化功能。但所用材料在實際應用中還存在周期長、成本較高等不足，后期也需要對其環境安全影響進行研究。

4 結論

（1）吸附法和包埋法均能將pd01 脫氮副球菌（T）、假單胞菌d4-1（J）和拉烏爾菌（L）固定在生物炭表面。

（2）吸附法固定T 和J，使生物炭微孔、介孔容積減小，同時也縮小了比表面積；吸附固定L后，生物炭比表面積和微孔容積增大，但介孔和大孔容積減小。而包埋法固定微生物則使生物炭大孔、介孔以及比表面積都大幅降低，微孔幾乎被全部封堵，同時引入C—H、—CH2和芳香酸酯C=O等新官能團。