聯氨基姜黃素誘導DC細胞成熟抑制小鼠皮膚鱗癌進展的機制研究

尤其　　郭輝　　孔凡慧　　王冬梅

[摘要] 目的 研究聯氨基姜黃素誘導DC細胞成熟抑制小鼠皮膚鱗癌進展的機制。 方法 梯度濃度（1/5/10/50/100/500 μM）的聯氨基姜黃素處理SCC細胞系SCL-1 48 h，MTT檢測細胞活性。同時構建自發性SCC小鼠模型，給予藥物處理觀察腫瘤進展情況，流式檢測腫瘤組織樹突狀成熟狀態。Western blot檢測聯氨基姜黃素處理前后樹突狀細胞STAT3通路的變化。 結果 不同濃度的聯氨基姜黃素在處理SCC細胞系SCL-1的過程中可能會對細胞的活性產生抑制作用，差異有統計學意義（P<0.05）。 半數最大抑制濃度值（IC50）為18.7 μM。正常C57BL/6小鼠在為期2周的腸胃給藥處理以后，通過與對照組進行比較發現其體重的變化并不顯著。自發性SCC小鼠模型在接受聯氨基姜黃素處理后，抗腫瘤的效果較為突出，差異有統計學意義（P<0.05）。流式檢測SCC小鼠的腫瘤組織，發現聯氨基姜黃素處理可促進樹突狀細胞成熟（CD80/CD86明顯上調），差異有統計學意義（P<0.05）。進一步Western blot檢測聯氨基姜黃素處理前后樹突狀細胞 STAT3通路發現處理組 STAT3磷酸化水平顯著下調，差異有統計學意義（P<0.05）。 結論 聯氨基姜黃素可在體外殺傷SCC細胞，并在體內促進樹突狀細胞成熟進而抑制SCC進展，其可能的機制是通過抑制 STAT3磷酸化，抑制STAT3通路。

[關鍵詞] 聯氨基姜黃素;皮膚鱗狀細胞癌;增殖;樹突狀細胞;STAT3

[中圖分類號] R739.5? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）12-0039-04

Study on the mechanism of DC maturation induced by hydrazinocurcumin in inhibiting mouse skin squamous cell carcinoma

YOU Qi1? ?GUO Hui2? ?KONG Fanhui1? ?WANG Dongmei3

1.Department of Clinical Laboratory， Zhejiang Provincial Tongde Hospital， Hangzhou? ?310012， China; 2.Special Service Center of the Air Force in Hangzhou， Hangzhou? ?310013， China; 3.Department of Dermatology， Zhejiang Provincial Tongde Hospital， Hangzhou? ?310012， China

[Abstract] Objective To study the mechanism of DC maturation induced by hydrazinocurcumin in inhibiting mouse skin squamous cell carcinoma. Methods SCC cell line SCL-1 was treated with hydrazinocurcumin at gradient concentration（1/5/10/50/100/500 μM） for 48 h， and cell activity was determined by MTT. At the same time， the spontaneous SCC mouse model was constructed， the tumor progression was observed after drug treatment. The dendritic maturation state of tumor tissues was detected by flow. The changes of STAT3 pathway in dendritic cells before and after treatment with hydrazinocurcumin were observed by Western blot. Results Different concentrations of hydrazinocurcumin may inhibit the activity of cells in the treatment of SCC cell line SCL-1， and the difference was significant（P<0.05）. The median maximum inhibitory concentration（IC50） was 18.7 μM. After normal C57BL/6 mice were given gastrointestinal administration of the drug for two weeks， their weight did not change significantly when compared with the control group. After treatment with hydrazinocurcumin， the antitumor effect of spontaneous mouse model was more prominent， and the difference was significant（P<0.05）. Flow cytometry detection of tumor tissues in SCC mice showed that treatment with hydrazinocurcumin could promote dendritic cell maturation（CD80/CD86 was significantly up-regulated）， and the difference was statistically significant（P<0.05）. Further Western blot analysis of the STAT3 pathway in dendritic cells before and after treatment with hydrazinocurcumin showed that the STAT3 phosphorylation level in the treatment group was significantly down-regulated（P<0.05）. Conclusion Hydrazinocurcumin can kill SCC cells in vitro and promote the maturation of dendritic cells in vivo， thus inhibiting the progression of SCC. The possible mechanism is to inhibit the STAT3 pathway by inhibiting the STAT3 phosphorylation.

[Key words] Hydrazinocurcumin; Cutaneous squamous cell carcinoma; Proliferation; Dendritic cell; STAT3

姜黃的活性成分為姜黃素，其為一種被廣泛應用于疾病治療的植物化合物[1，2]。聯氨基姜黃素（Hydrazinocurcumin）的藥理性更為顯著，因此，可大大提升生物的利用程度[3]。前期研究證明HC是STAT3磷酸化的有效抑制劑。它可以下調一系列STAT3下游靶標，從而在體外抑制細胞增殖，集落形成喪失，抑制細胞遷移和侵襲以及誘導細胞凋亡[4-6]。然而HC對于腫瘤免疫微環境的調節少有討論。本研究探討HC對于皮膚鱗狀細胞癌（Skin squamous cell carcinoma，SCC）小鼠模型成瘤的抑制作用，觀察其對腫瘤生長以及腫瘤組織中樹突狀細胞（Dendritic cell，DC）成熟水平影響，并進一步研究其分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株和試劑

DMEM培養基、雙抗、胎牛血清購自 Gbico（美國），流式抗體 Zombie、PE-CD80、 APC-CD86、FITC-CD11 c購自Becton Dickinson（美國），二抗購自Invitrogen（美國），一抗（anti-STAT3、anti-p-STAT3）、增強型發光試劑盒購自Santa Cruz Biotechnology（美國），內參GAPDH購自 Abclonal（中國），PVDF膜購自Millipore（美國），rmGM-CSF、IL-4、 DMBA、TPA、丙酮溶液均購自Sigma（美國），DMSO、MTT試劑盒從武漢谷歌生物公司購入。酶聯免疫檢測儀為美國Thermo公司產品（IED0501003M），流式細胞儀為美國Becton Dickinson公司產品（LSRFortessa）。

1.2 細胞培養和聯氨基姜黃素處理

SCL-1細胞源自于上海中科院的細胞庫，DMEM+10胎牛血清在5%CO2的條件下培育。DMSO配制的聯氨基姜黃素濃度不一，針對所采集的細胞標本，將細胞懸液的濃度調配為5萬/mL。在MTT實驗中，將每個孔注入100 μL細胞懸液，之后再結合MTT實驗流程和要求，在不同的小組內再分別設立6個復孔，通過相關的檢測儀來判斷細胞是否有活性。

1.3 小鼠骨髓樹突狀細胞提取和HC處理

對于C57BL/6小鼠采用頸椎脫位法將其致死，在無菌的環境下將其股骨和脛骨取出，然后吸取1X的PBS溶液，用胰島素針從骨干的一端扎入骨髓腔，并將骨髓沖洗到器皿內。每根骨頭的沖洗次數為4～6次。將器皿中的骨髓液集中起來進行離心操作，緊接著再添加紅細胞裂解液，容量為5 mL。配制DMEM+rmGM-CSF（10 ng/mL）+IL-4（10 ng/mL）培養基培養裂紅后細胞沉淀。將細胞培養板置于室溫為37℃且含5% CO2的孵箱環境中進行培養，對于培養液則每間隔2.5 d換置1次。提供為期1周的rmGM-CSF。除外，PBS或10 μM HC處理24 h。

1.4 SCC小鼠模型構建

采用國際上通用的兩步致癌法建立SCC小鼠模型。取5～6周C57BL/6小鼠20只，清除背部毛發待用。將 DMBA和TPA溶于丙酮配成母液，使用時DMBA濃度為 250 ng/μL，TPA濃度為50 ng/μL。用移液槍向小鼠背部的剃毛區涂抹200 μL濃度為250 ng/μL的DMBA溶液，DMBA將作為腫瘤誘變劑，引起小鼠皮膚基因的突變。1周后，用同樣方法在每只小鼠的相同部位涂200 μL濃度為50 ng/μL的TPA溶液，TPA每周以相同劑量涂抹2次，共需涂抹20周。為保證小鼠背部對藥物的充分吸收，每次涂藥之前都應該盡量將小鼠新長出的毛發剃除干凈，且每次涂藥位置相同。處理組在TPA溶液涂抹3 d后，給予聯氨基姜黃素干預，給藥量相當于臨床用藥的等效劑量（聯氨基姜黃素80 mg/kg），每天用藥次數為1次，堅持20周。每天將用藥后小鼠的變化情況如實記錄。

1.5 聯氨基姜黃素體內毒性驗證

選取10只正常的C57BL/6小鼠，然后將其細分為兩組，一是對照組，二是處理組，對于后一組則持續用藥2周，每天將小鼠的體重變化情況予以如實記錄。

1.6 腫瘤組織樹突狀成熟水平檢測

分別從對照組和處理組中取小鼠的腫瘤組織，然后加以研磨，并進行低速離心5 min。基于實際狀況來決定是否有必要處理裂解的紅細胞。計數以后，用適量PBS研配單細胞懸液。將流式管做好標記，分別將50 μL腫瘤組織研磨成的單細胞懸液轉移到流式管中。分別標記抗體Zombie、FITC-CD11c、PE-CD80、PE-CD86，避光冰上孵育30 min。將1 mL PBS分別加入各個流式管中，對于過剩的熒光抗體則使用緩沖溶液予以洗滌，同時再重復3次進行低速離心操作，每次時間控制在5 min。將沉積的細胞進行清理，各個試管中加入100 μL PBS緩沖液重懸，之后再進行檢驗。

1.7 Western blot檢測STAT3、p-STAT3蛋白表達水平

細胞在RIPA緩沖液中裂解?？偟鞍诐舛认嗤⑥D移到PVDF膜。在進行密封之后置于4℃的環境下孵育一抗24 h。孵育后的條帶在Tris-buffered saline Tween（TBST）緩沖液中進行3次洗滌操作，同時，置于室溫孵育二抗，時長為60 min。對于蛋白的表達情況使用增強型化學發光試劑盒予以檢測，最后再通過Image J灰度予以相關性研究。

1.8 統計學方法

用 GraphPad Prism5.0統計所得實驗數據，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，對于所得結果借助單因素方差進行數理化分析，同時進行t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 聯氨基姜黃素體外可顯著抑制SCL-1細胞增殖

濃度不一的聯氨基姜黃素處理SCC細胞系SCL-1 2 d后，通過MTT對細胞的活性程度予以檢測。最后發現，與對照組相比，處理后的細胞活性顯著下降（圖1）。聯氨基姜黃素半數抑制濃度值（IC50）最大則為18.7 μM。則充分說明在體外使用聯氨基姜黃素也可有效抑制SCC細胞的成熟速度。

2.2 聯氨基姜黃素抑制DMBA/TPA誘導的SCC形成

處理組在TPA溶液涂抹3 d后，每日給予聯氨基姜黃素灌胃處理。每周檢測1次腫瘤組織，當腫瘤組織平均直徑大于1 mm后，每周記錄1次兩組小鼠腫瘤組織直徑。發現聯氨基姜黃素處理組小鼠腫瘤組織增長明顯受抑（圖2A），差異有統計學意義（P<0.05）。濃度相似的聯氨基姜黃素處理正常 C57BL/6小鼠，在對小鼠體重變化的記錄中得知，兩個小組均沒有任何差異（圖2B）。證明在小鼠可耐受藥物濃度下，聯氨基姜黃素可顯著抑制SCC進展。

2.3 聯氨基姜黃素誘導腫瘤樹突狀細胞成熟

取SCC模型腫瘤組織研磨行細胞流式檢測，發現聯氨基姜黃素可改善抑制性的腫瘤免疫微環境。通過小組比較發現，處理組樹突狀細胞更為成熟（封三圖3），差異有統計學意義（P<0.05）。提示聯氨基姜黃素可通過促進抗原提呈細胞功能狀態抑制SCC進展。

2.4 聯氨基姜黃素抑制樹突狀細胞STAT3通路

將小鼠骨髓中的單核細胞提取出來，之后再借助rmGM-CSF聯合IL-4誘導分化為樹突狀。聯氨基姜黃素孵育24 h后，Western blot研究STAT3通路蛋白水平改變情況。實驗結論發現，聯氨基姜黃素孵育后STAT3總蛋白不變，磷酸化水平明顯降低（封三圖4）。Image J灰度分析得出，差異有統計學意義（P<0.05）。則說明樹突狀細胞蛋白磷酸化在被聯氨基姜黃素抑制以后，會使得樹突狀細胞加快分化。

3討論

隨著人口老齡化危機的到來，皮膚癌的發病率將逐漸上升[7，8]。SCC在皮膚惡性腫瘤中占據很大比重。侵襲性SCC將在較大程度上影響死亡的可能性。雖然SCC可與外科手術、放射和化療單獨或組合地進行處理，患有轉移性SCC預后依舊亟需改進[9，10]。如何對傳統的療法進行優化和創新，是當前醫學研究中急需解決的重大難題。

結合一系列的分析得知，對于癌細胞的控制，聯氨基姜黃素可起到顯著的抑制效果。由于姜黃素具有多種抗癌特性，在乳腺癌、肝癌等多種實體瘤中展現出令人矚目的殺傷效果。因此多項臨床試驗相繼開展來研究聯氨基姜黃素的抗腫瘤效果[11，12]。體外實驗中，研究證明聯氨基姜黃素可通過介導STAT3去磷酸化、抑制p38 MAPK通路等多種機制影響腫瘤細胞的生命活動。除外還有專家分析得知，聯氨基姜黃素可借助抑制STAT3通路重編程腫瘤相關巨噬細胞向型極化，進而對乳腺癌的惡化起到明顯的抑制效果。本研究發現聯氨基姜黃素可在體外顯著殺傷SCC細胞系SCL-1。同時，利用DMBA/TPA兩步誘導法建立的SCC小鼠模型驗證了聯氨基姜黃素在體內抑制SCC的進展。

為深入研究聯氨基姜黃素如何有效地抑制SCC小鼠模型，本研究通過細胞流式實驗發現，聯氨基姜黃素處理可顯著誘導 SCC組織中抗原提呈細胞樹突狀細胞的成熟與分化，激活抗腫瘤免疫，進而抑制 SCC的發展。在整個免疫系統中，比較重要的抗原呈遞細胞（APC）是樹突狀細胞，在提升機體的免疫能力方面其作用較顯著[13-15]。通過對腫瘤細胞進行吞噬，可使抗腫瘤免疫力被激活。最近幾年，抗腫瘤免疫治療技術顯著提升，因此，醫學界對樹突狀細胞在抗腫瘤免疫中所產生的影響高度重視[16，17]。前期研究發現，STAT3是抑制樹突狀細胞成熟的重要因素[18]。轉錄調節子STAT3在脊椎動物發育和成熟組織功能（包括控制炎癥和免疫）中起關鍵作用。在多種腫瘤中檢測到異常/不受抑制的STAT3活性，從而驅動多種促癌功能。為此，STAT3被廣泛認為是一種癌基因，并且是大量翻譯研究的對象。然而，該因素的顯著特征之一是其在不同條件下引起不同的、有時是相反的效果的能力。根據腫瘤病因/突變情況，STAT3的活性已被證明是促癌或抑制腫瘤，提示強調其功能的分子基礎仍不完全清楚[19-20]。因此本研究利用 Western blot實驗驗證發現，聯氨基姜黃素通過抑制 STAT3蛋白磷酸化水平，促進CD80/CD86表達，誘導樹突狀細胞的成熟。

綜上所述，本研究首次發現聯氨基姜黃素抗SCC的功能，并利用自發性SCC小鼠模型探討聯氨基姜黃素對SCC腫瘤免疫微環境的影響。最后分析得出，對于STAT3的磷酸化，聯氨基姜黃素可起到顯著的抑制作用，與此同時，還可加快樹突狀細胞的分化，最終達到抑制腫瘤惡化的目的。本研究認為，聯氨基姜黃素作為一種成熟的臨床用藥，可為SCC治療提供新方向，具有重要的理論價值和臨床意義。

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（收稿日期：2020-05-08）