聊城地區新德里金屬β-內酰胺酶菌株的分子流行病學及感染危險因素研究

田金靜 康亞麗 路秀芳 任更樸

山東第一醫科大學附屬聊城二院 山東省聊城市第二人民醫院檢驗科，山東聊城 252600

隨著碳青霉烯類抗生素藥物的廣泛應用，臨床耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌（carbapenem resistant enterobacteriaceae，CRE）日益增多[1-2]。現已證明，產新德里金屬β-內酰胺酶（New Delhi metalloβ-lactamases，NDM）能夠水解除單β-內酰胺類之外所有β-內酰胺類抗生素，是介導CRE產生的主要因素之一[3]。研究顯示[4-5]，CRE中NDM基因型檢出率較低，且對NDM陽性菌株感染的危險因素及預后的報道極少，尤其是聊城地區對其NDM陽性菌株分子流行病學及感染危險因素的研究仍為空白[6]。因此，本研究收集符合要求的2014年1月至2018年12月臨床分離的非重復的碳青霉烯類耐藥的腸桿菌科細菌為研究對象進行研究。探討聊城地區新德里金屬β-內酰胺酶菌株的分子流行病學及感染危險因素。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 收集目標菌株

經過我院醫學倫理委員會批準實施本次研究。采用分層抽樣法從聊城地區2014年1月至2018年12月15所醫院中抽取樣本5689例，其中，臨床標本中分離的碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌共112份。112份樣本中，其中男58例，女54例，年齡18～70歲，平均（46.36±11.65）歲。所有菌株均經過Vitek 2-Compact細菌鑒定分析儀（法國生物梅里埃）進行鑒定，鑒定卡片為GN卡（法國生物梅里埃），藥敏試驗采用瓊脂稀釋法，嚴格按照2018年CLSI的標準進行藥敏試驗和結果判定。質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

納入標準：①均符合碳青霉烯類耐藥的腸桿菌科細菌的質控標準；②屬地均位于山東省聊城地區的樣本；③符合制備和保存標準的標準。

1.2 耐藥表型及基因型檢測

碳青霉烯酶表型確證試驗采用改良Hodge試驗、ETP-EDTA協同試驗及mCIM試驗。采用PCR法擴增以下碳青霉烯酶基因，包括Ambler A組酶基因（blaKPC、blaNMC、biaSME、blalMI、blaGES），Ambler B組 酶 基 因（blaIMP、blaVIM、blaSPM、blaGIM、blaSIM、blaNDM），Ambler D組 酶 基 因（blaOXA），其他β-內酰胺酶基因（blaCTX-M）。陽性和陰性質控樣本跟隨每批PCR試驗。使用ABI 3730X自動測序儀進行基因測序（北京博邁德生物工程公司），其測序結果至Genbank數據庫（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/）使用BLAST軟件比對以確定β-內酰胺酶基因型。采用脈沖場凝膠電泳（PFGE）及多位點序列分型（MLST）技術確定其等位基因譜及菌株序列型（ST型）。

1.3 病歷信息收集

采用回顧性研究的方法，制作調查表后查閱NDM陽性菌株感染的患者出院病歷，調查內容包括以下觀察指標：患者的住院科室、姓名、性別、年齡、住院時間、抗生素使用史、基礎疾病、危險因素、臨床結局等資料。

1.4 技術路線

見圖1。

圖1 技術路線

1.5 統計學處理

數據處理使用SPSS 21.0統計分析軟件完成。計量資料以（）表示，采用t檢驗，計數資料以[n（%）]表示，采用Fisher確切概率法檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。多因素分析采用多因素Logistic回歸分析，計算優勢比（OR）和95%可信區間。

2 結果

2.1 感染危險單因素分析

采用分層抽樣法從聊城地區2014年1月至2018年12月期間15所醫院中抽取樣本5689例，其中，臨床標本中分離的碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌共112份，發生率1.97%。可見，不同危重度（符合并入住ICU）、合并基礎疾病（2種及以上）、存在侵入性操作、使用糖皮質激素、使用免疫抑制劑藥物是碳青霉烯類耐藥情況下碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌感染率差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 感染危險單因素分析[n（%），n=5689]

2.2 核心變量賦值表變量賦值

核心變量賦值表變量賦值見表2。

表2 變量賦值表

2.3 感染危險多因素分析

將危重度合并基礎疾病情況、是否侵入性操作、是否使用糖皮質激素、是否使用免疫抑制劑藥物納入Logistic回歸分析模型，結果顯示，危重度（符合并入住ICU）、合并基礎疾病（2種及以上）、存在侵入性操作、使用糖皮質激素、使用免疫抑制劑藥物是碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌感染的獨立危險因素（P＜0.05），見表3。

2.4 藥敏試驗結果

26株產NDM腸桿菌科細菌呈現多重耐藥性，其中7株對亞胺培南耐藥、8株對厄他培南耐藥、6株對美羅培南耐藥，5株對3種藥物都敏感。

2.5 耐藥基因檢測結果

PCR結果顯示，26株產NDM的大腸埃希菌分為4個基因型，其中9株D型，8株B型，5株C型，4株A型。見表4。

3 討論

自2010年，我國浙江地區首次報道產NDM-1酶肺炎克雷伯菌以來，全國各地區均有所報道，發生率呈逐年上升趨勢[7]。據2013年的報道，我國主要的碳青霉烯酶是KPC-2，約占70.6%，一部分CRE由IMP-4等碳青霉烯酶引起，NDM基因導致的CRE發生率各地區、腸桿菌科各種屬間差別較大[8]。2014年山東地區首次報道新生兒科病房暴發產NDM-1肺炎克雷伯菌院內感染。尤其需要重視的是碳青霉烯類耐藥基因通常位于可克隆傳播和水平傳播的質粒上，因此容易引起院內腸桿菌科細菌間耐藥性的廣泛傳播[9]。有學者推測我國的NDM陽性流行株主要源于本土，且攜帶NDM耐藥質粒的鮑曼不動桿菌在NDM的播散中起到了重要作用[10]。

到目前為止，法國、德國、西班牙、瑞典、日本和中國香港、臺灣、大陸等地均已發現攜帶NDM-l的菌株。據患者感染情況及細菌本身特點，專家認為產NDM-1細菌可能主要通過密切接觸感染。易感人群包括疾病危重、入住重癥監護室、長期使用抗菌藥物、基礎疾病、侵入性操作、糖皮質激素或免疫抑制劑藥物使用等患者[11]。感染后患者臨床表現與敏感細菌沒有差別，但對一般抗菌治療無效。因此，我們需要通過對聊城地區住院患者臨床分離的碳青霉烯酶耐藥基因分型進行研究，以明確本地區以何種基因型為主，進一步研究本地區CRE中的NDM菌株流行病學情況，從而提高抗感染經驗性用藥的有效性，控制其傳播，減少NDM菌株感染的發生，為制定預防和控制CRE院內感染的策略和措施提供科學的依據[12-13]。

表3 感染多因素Logistic回歸分析結果

隨著碳青霉烯類抗生素在臨床上廣泛使用，腸桿菌科細菌的耐藥性問題日益嚴重。產碳青霉烯酶是耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌（CRE）主要的耐藥機制，其中，新德里1型金屬β-內酰胺酶（NDM-1）是一種新型碳青霉烯酶，耐藥表型和傳播機制不同于其他碳青霉烯酶[14]。2016年中國一次大規模調查表明耐藥機制已發生變化，每個地區有所不同，NDM金屬酶在碳青霉烯酶中占據越來越大的比例。

表4 耐藥基因檢測結果

研究發現，NDM酶在聊城地區分離的CRE中出現高發流行，《產NDM泛耐藥腸桿菌科細菌感染診療指南》強調，下一步要加強對產NDM細菌的監測及抗菌藥物合理使用管理。據有關文獻報道，腸桿菌科細菌對碳青霉烯類藥物產生的耐藥機制不同，臨床用藥也有所不同，如新藥頭孢他啶/阿維巴坦的上市給革蘭陰性細菌感染的治療帶了新的選擇，但遺憾的是它對A類和C類具有良好活性，但對于B類（NDM、IMP）沒有效果[15]。

本研究結果顯示，5689例樣本中，臨床標本中分離的碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌共112份，發生率1.97%。可見，不同危重度、合并基礎疾病、存在侵入性操作、使用糖皮質激素、使用免疫抑制劑藥物是碳青霉烯類耐藥情況下碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌感染率差異有統計學意義（P＜0.05）。Logistic回歸分析模型，結果顯示，危重度（符合并入住ICU）、合并基礎疾病（2種及以上）、存在侵入性操作、使用糖皮質激素、使用免疫抑制劑藥物是碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌感染的獨立危險因素（OR=1.977、1.558、1.103、1.078、1.770，P＜0.05），26株產NDM腸桿菌科細菌呈現多重耐藥性，其中7株對亞胺培南耐藥、8株對厄他培南耐藥、6株對美羅培南耐藥，5株對3種藥物都敏感。PCR結果顯示，26株產NDM的大腸埃希菌分為4個基因型，其中9株D型，8株B型，5株C型，4株A型。

綜上所述，金屬β-內酰胺酶的大腸埃希菌呈現出流行爆發的趨勢，并呈現出多重耐藥的特點，且可通過質粒在菌種間進行水平傳播。因此，我們應加強對聊城地區CRE的分子流行病學及NDM菌株的流行趨勢的研究，以指導臨床更加快速的選擇有效的抗菌藥物，提高患者的治愈率，為今后控制CRE的感染以及暴發流行提供依據。