益母縮宮顆粒對藥物不全流產大鼠血漿FN、LN、ColIV的影響

黃正迎，毛惠，李品英

（1.西南醫科大學，四川 瀘州 646000；2.西南醫科大學附屬中醫醫院，四川 瀘州 646000）

0 引言

2017年我國衛生和計劃生育統計年鑒的數據表明，2016年中國的人工流產人數達964萬[1]。而人工流產中無論是負壓吸引術還是藥物流產，均會損傷子宮內膜，破壞女性本身的防護屏障，對女性生殖系統及其功能造成潛在危害[2]。近年來運用米非司酮和米索前列醇終止早孕的方法在全世界范圍內廣泛使用；藥物流產作為簡便、有效的非手術終止妊娠的方法，被大多數婦女所接受，它還具備病人樂意接受、減少住院次數等優點[3]。藥物流產與負壓吸引術相比，避免了漏吸、空吸、子宮穿孔、人工流產綜合征等并發癥，但也會出現不全流產、絨毛蛻膜殘留、子宮異常出血等常見并發癥，使其在臨床應用過程中受到一定的限制，研究縮短和減少藥物流產后子宮異常出血的治療方法顯得尤為重要。我院院內制劑益母縮宮顆粒廣泛用于藥物流產、順產后，前期臨床研究表明其可通過調節內分泌激素、改善凝血功能來幫助子宮內膜修復、促進子宮復舊從而減少藥物流產后子宮異常出血[4-6]，但其作用機制仍不十分明確。本次研究通過建立米非司酮+米索前列醇建立藥物不全流產大鼠模型，經益母縮宮顆粒干預后，測定大鼠血漿中FN、LN、ColIV的值，從而探討益母縮宮顆粒參與藥物流產后子宮內膜修復、減少子宮異常出血的作用機制與細胞外基質的關系。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

SPF級性成熟SD大鼠，雄性大鼠25只，雌性大鼠60只，均由西南醫科大學實驗動物中心提供；雌性大鼠體重220～260g，雄性大鼠體重250～280g，許可證號 SCXK（川）2018-17。購買后分籠適應性喂養1周，大鼠全天自由飲水，繁殖飼料喂養；培育室溫度21℃-22℃，濕度60%-80%，人工光照（12h晝，12h夜）；均飼養于西南醫科大學實驗動物中心（許可證號SYXK（川）2018-065）。

1.2 實驗藥物

益母縮宮顆粒，10g/袋，批號：20191119,西南醫科大學附屬中醫醫院。

米非司酮，25 mg/片，批號：432005041，華潤紫竹藥業有限公司。

米索前列醇，0.2 mg/片，批號：43200304，華潤紫竹藥業有限公司。

縮宮素，1mL/支，1mL：10單位，批號21908013，南京新百藥業有限公司。

注射用苯巴比妥鈉，0.1g/瓶，批號190503，上海上藥新亞藥業有限公司，使用時用生理鹽水配制成10%溶液，按50mg/Kg腹腔注射麻醉。

所有灌胃藥物均根據人鼠劑量比換算成大鼠灌胃劑量，成人體重按60 kg計算。

1.3 主要試劑及儀器

試劑：Rat FN ELISA KIT，貨號：ZC-37348，規格：96孔/盒，上海茁彩生物科技有限公司生產；Rat LN ELISA KIT，貨號：ZC-36446，規格：96孔/盒，上海茁彩生物科技有限公司生產；Rat Col IV ELISA KIT，貨號：ZC-36018，規格：96孔/盒，上海茁彩生物科技有限公司生產。

儀器與耗材：計算機，型號 TFT185W80PS，冠捷顯示科技有限公司生產；酶標儀，型號pectraMAX Plus384，美谷分子儀器有限公司生產；優普超純水制造系統，型號 UPH-Ⅱ-10T，成都超純科技有限公司生產；高速微量離心機，型號：5424GI174620，德國艾本德股份有限公司；電子恒溫水浴鍋，型號DZKW-4，北京中興偉業儀器有限公司生產；手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器，型號SYQ-DSX-280B，上海申安醫療器械廠生產；移液槍，規格，1000μL、200μL、20μL、10μL、2μL，大龍興創實驗儀器（北京）有限公司生產；槍頭，規格，1000μL、200μL、20μL，美國Axygen公司生產； EP管，規格：1.5mL、0.2mL、100μL，美國Axygen公司生產。

2 實驗方法及步驟

2.1 實驗動物造模、分組及給藥

參照王曉東[7]造模法制備藥物不全流產大鼠模型，選擇SPF級成熟雌性大鼠60只，成熟雄性大鼠25只，適應性喂養7天后，隨機挑選10只未合籠雌性大鼠作為空白組。其余大鼠按照雌雄2：1比例于下午18時合籠，次日晨8時檢查陰道涂片，發現有精子者為妊娠第1天。若雌鼠未受孕，則繼續于下午18時與雄鼠按2:1合籠，連續合籠3-5天，然后換批次繼續合籠。最終受孕大鼠，均于妊娠第7天早上8時灌服米非司酮（8.3mg/kg），下午18時灌服米索前列醇（100ug/kg），并在雌性大鼠陰道內置入一個清潔棉球，次日檢查大鼠陰道內棉球，查見血跡則基本認為造模成功。

將最終造模成功的48只大鼠隨機分為5組，分別為：模型組、縮宮素對照組（縮宮素組）、益母縮宮顆粒低劑量組（低劑量組）、益母縮宮顆粒中劑量組（中劑量組）、益母縮宮顆粒高劑量組（高劑量組），其中高劑量組和中劑量組每組9只，其余各組每組10只。上訴各組大鼠分別于妊娠第8天開始做如下處理：模型組：灌胃動物飲用水（NS）連續7天（每只灌胃飲用水1mL/（100g.d））；縮宮素對照組：連續3天肌注縮宮素0.9U/（kg.d）。益母縮宮顆粒各組：灌胃益母縮宮顆粒，低劑量組1.562g/（kg.d），中劑量組3.125g/（kg.d）、高劑量組6.25g/（kg.d）連續7天。而空白組大鼠則于妊娠第7天開始，灌胃實驗中心實驗動物飲用水1mL/（100g.d），連續8天。大鼠按1mL/100g計算灌胃量。

2.2 動物標本的采集

各組大鼠于妊娠第15天時，予以10%苯巴比妥鈉腹腔注射麻醉。解剖大鼠，找到腹主動脈，抽取血液約5mL，靜置半小時，采集上層血清離心機離心（3200r，12min），以無菌吸管吸取上層血清約2mL，凍存于-80℃冰箱，以待后續檢驗。

2.3 指標檢測方法與步驟

2.3.1 指標檢測方法

本實驗將FN、LN、ColIV抗體包被于96孔微孔板中，制成固相載體，向微孔中分別加入標準品或者樣本，其中的FN、LN、ColIV連接于固相載體上的抗體結合，然后加入辣根過氧化物酶標記的抗體，將未結合的抗體洗凈后再次加入TMB底物顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的FN、LN、ColIV呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

2.3.2 具體步驟

①復溫：將所有試劑逐漸平衡至室溫。②加樣：空白孔，空白對照孔不加樣品，只加顯色劑A、B和終止液用于調零；標準品孔，加入配好的標準品50μL，然后加入辣根過氧化物酶100μL；待測樣品孔，加入樣本50μL，然后辣根過氧化物酶100μL，蓋上封板膜，輕輕振蕩混勻，37℃溫育60min。③配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。④洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置1min后棄去，如此重復5次，拍干。⑤顯色：每孔先加入底物液A50μL，再加入底物液B50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15min。⑥終止：每孔加終止液50μL，終止反應。在15min內，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。

2.4 統計學方法

實驗數據資料用SPSS 25.0統計軟件進行統計分析，所有資料均為數值變量且符合正態性及方差齊，使用單因素方差分析（one-way ANOVA）進行數據統計，組間比較用LSD-t法進行分析，所有數值以均數±標準差（±s）表示。P＜0.05則認為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 妊娠第15天時，各組大鼠血漿FN、LN的水平變化

表1 各組大鼠血清中FN、LN濃度的變化（±SD）

與模型組相比，空白組、縮宮素組大鼠血漿FN、LN水平明顯降低，有明顯統計學差異（P＜0.01）；中劑量組、高劑量組血漿FN、LN降低，有統計學差異（P＜0.05）；而低劑量組與模型組相比，有下降趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

與空白組相比，模型組、低劑量組血漿FN、LN水平升高，統計學差異明顯（P＜0.01）；縮宮素組、中劑量組、高劑量組血漿FN、LN水平有上升趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見表1。

3.2 妊娠第15天時，各組大鼠血漿ColIV的水平變化

表2 各組大鼠血漿中Col IV濃度的變化（±SD）

與模型組相比，空白組、縮宮素組、中劑量組、高劑量組大鼠血漿Col IV水平降低，有明顯統計學差異（P＜0.01）；而低劑量組有下降趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

與空白組相比，模型組、低劑量組血漿Col IV水平上升，差異明顯（P＜0.01），而縮宮素組、中劑量組、高劑量組與空白組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見表2。

4 討論

纖維連接蛋白(fibronectin,FN)、層粘連蛋白(laminin,LN)、膠原纖維、糖蛋白等是組成細胞外基質（extraceliular mat riX，ECM）的主要成分。生理狀態下，ECM 處于不斷生成和降解的動態平衡中,影響著細胞的增殖、分化、粘附、形態發生等過程；若ECM過度生成則會導致組織器官的纖維化[8-9]。子宮內膜周期性的脫落伴隨出血、止血和修復、增殖、分化等過程也涉及到ECM的水解[10]。

FN主要分為血漿纖維連接蛋白和細胞纖維連接蛋白，是一種非膠原糖蛋白。血漿纖維連接蛋白具有促進組織修復、增加細胞間連接、調節細胞分裂和增殖等作用；細胞纖維連接蛋白在細胞之間起連接作用，影響細胞的遷移與分化[11]。FN在子宮組織中主要分布于絨毛上皮基膜、絨毛間質、蛻膜間質及滋養細胞中，它在月經周期中主要參與子宮內膜的脫落和修復、內膜脫膜化及胚胎著床等各個方面，且具有重大意義[12-13]。

層粘連蛋白(laminin,LN)存在于基底膜中，也是一種特有的非膠原糖蛋白；它與Ⅳ型膠原一起構成基膜, 能共同連接和維持組織的形態。LN是胚胎發育中最早出現的ECM成分，它和FN在子宮內膜上的分布相似，是蛻膜細胞生長發育所需微環境的重要物質，在細胞生長、分化、增殖及細胞黏附中起關鍵作用[14-15]。而IV型膠原呈薄網狀分布于多種組織基底膜中，屬于基膜膠原；它可使組織結構更完整，為其他生物大分子的組裝提供框架[16-17]。

相關研究發現，米非司酮及米索前列醇可以使蛻膜組織中FN、LN的水平較正常妊娠時明顯下降，使胚胎與子宮內膜的聯系中斷，從而抑制胚胎的早期發育；而ColIV的下降使得其對胚胎的支持連接作用也消失，使胚胎從子宮內膜上脫落，排出體外[18]。

藥物不全流產是指口服米非司酮及米索前列醇后，宮內妊娠組織排出不全，蛻膜組織及絨毛組織殘留宮腔的一種并發癥，其危害主要是長期異常子宮出血、繼發感染、月經紊亂等。本研究結果顯示，中劑量組、高劑量組及縮宮素組均可降低藥物不全流產大鼠血漿中FN、LN的水平，其中縮宮素下降效果明顯；縮宮素組、中劑量組及高劑量組均可降低大鼠血漿中Col IV的水平，且三組差異均較明顯。藥物不全流產后高水平的FN、LN、ColIV使得蛻膜絨毛組織與子宮內膜緊密黏附，而殘留的蛻膜絨毛組織使得子宮收縮乏力，持續異常出血；而縮宮素、益母縮宮顆粒通過降低血漿中FN、LN、ColIV的水平，減少蛻膜絨毛組織與子宮內膜的黏附，從而使蛻膜絨毛組織排出體外，減少子宮異常出血。

綜上所述，益母縮宮顆粒減少藥物不全流產后子宮異常出血的機制，可能是通過降低藥物不全流產大鼠血漿FN、LN及ColIV的表達，促進殘留絨毛、蛻膜組織的排出，從而加速受損子宮內膜基質的修復。但益母縮宮顆粒的此種作用具體通過什么途徑調節，仍待下一步研究討論。