骨康靈液在骨折愈合中影像學及組學的研究

王瓊仙，楊騏睿，李成，王金偉，吳春妍，吳林雄

（1 昆明醫科大學實驗動物學部,云南 昆明；2 云南省骨科醫院,云南 昆明；3 昆明醫科大學公衛學院,云南 昆明；4昆明醫科大學藥學院,云南 昆明)

0 引言

骨康靈液是一種院內制劑，是由昆明醫學院科研中試中心研發，經由云南省藥監局批準生產。由10 多味中藥經炮炙、加工、提取其有效成份后，對其進行一系列的制備，而最終形成的一種藥液，是一種外用藥物[1，2]。骨康靈液經過試驗發現，在接骨生新方面具有較好的效果，而且對于骨折患者恢復中的骨痂生長具有有效的促進作用，從而更好地幫助骨折患者康復，另外在外傷性閉合骨折及跌打損傷、關節紅腫疼痛等疾病中，還可有效發揮其活血化瘀、消腫止痛的效用。

1 骨康靈液發揮療效作用的動物實驗研究

1.1 材料與方法

儀器：普通醫用診斷X 攝線機（本部門實驗室）及手術器械等。

藥品：本院原制劑室提供，骨康靈液的批準文號為滇藥制字(z)20092434A。

1.2 動物模型的建立與評價

（1）分組：200只成年SD 大鼠，雌雄各半，體重（200±20）g，隨機分為四組。sham 組( 空白對照組),骨折組66只, 對照組( 骨折+95% 酒精組)66只和治療組(骨折+骨康靈液)68只，其中空白對照組均為各組的SD 大鼠股骨左側，其他3 組均為各組SD 大鼠股骨的右側，每組多用幾只動物備用。實驗動物購于昆明醫科大學實驗動物學部，實驗動物質量合格證號：SYSK(滇)2005-0004，許可證號SCXK(滇)2011-0004。

（2）制備骨折模型：隨機選擇右側股骨制造股骨中段骨折，利用X 線技術觀察患肢的具體情況，最后進行傷口的縫合處理(術后連續3d 每天按15萬/kg 劑量的青霉素進行肌肉注射，有效預防感染)。

（3）給藥：造模成功后，將藥棉或紗布上浸滿骨康靈液后，將其對治療組的患處進行充分的包纏，并利用小夾板對其進行有效的固定處理，需要注意的是，要保證患處的藥棉經常處于比較濕潤的狀態，每日可間隔6h 定時浸濕藥棉1次，4次/d，從而有效幫助患處的藥物吸收。分別于骨折造模成功給藥后第7、15、21、30、42、50d 各組每次分別大鼠行腹腔麻醉后10只做X-線攝片觀察骨折愈合情況及骨痂生長情況。對照組、治療組骨折給藥后1個月分別各取4只骨折斷端的骨組織放入-80℃冰箱保存，干冰運輸送檢。基因芯片和蛋白質譜檢測篩選骨康靈液發生療效的上下調基因及目標分子。對照組用西醫常規治療（95%酒精）。

1.3 X-線影像評分標準

1分：骨折斷端邊緣呈現出一種趨向性模糊，骨膜輕度反應，無骨痂可見；2分：斷端邊緣模糊，骨膜反應淺淡，骨痂少量，密度較淡，邊緣不整齊；3分：通過觀察可以發現仍然可以看到接近消失的斷端邊緣，骨膜反應較深，骨痂增加，但缺損未完全填充，密度較深，邊緣呈現出清晰的狀態；4分：斷端邊緣完全消失，骨膜反應密度與骨影相似，骨痂未填滿缺損，與骨皮質密度相同并未相互連接；5分：骨折恢復良好，斷端邊緣完全消失[3-5]。

1.4 統計學分析

以SPSS19.0 統計軟件處理數據。X 線影像評分等為計量資料，對其使用（±s）表示，組間的數據對比采用單因素方差分析和t檢驗，P＜0.05 為有統計學意義。

2 結果

2.1 各組造模后7-50d X 線分析

第7d 時，治療組與對照組影像學無明顯差異，治療組骨折端符合X-線影像評分中1分的標準；第15d 時，治療組有少量骨痂生長，邊緣明顯模糊，而對照組無骨痂生長；第21d 時，治療組骨折斷端骨密度有所增加，骨膜反應漸深，生成較多骨痂，斷端邊緣仍可見，對照組僅有少量骨痂生長；第30d 時，治療組骨密度進一步增加，骨膜反應較深，骨痂量已包繞骨折斷端，但骨折線清晰，對照組出現較多骨痂；第42d 時，治療組骨折線基本消失，骨膜密度接近骨質，骨痂填滿骨缺損，骨小梁力學結構漸為合理，對照組骨折線仍清晰，骨痂量較多，骨小梁雜亂；第50d 時X 線攝片，治療組大部分符合5分的標準。結果:治療組與對照組在造模第7d 的X 影像學無明顯差異(P＞0.05)，在造模50d 時治療組骨痂明顯多于對照組(P＜0.05)。見表1。

表1 各組造模后7-50d X 線影像評分[（±s）/分]

表1 各組造模后7-50d X 線影像評分[（±s）/分]

組別 n 7d 14d 21d 30d 42d 50d治療組 68 1.67±0.52 2.28±0.39 3.44±0.46 4.00±0.50 4.20±0.30 4.50±0.50對照組 66 1.00±0.55 2.00±0.27 3.00±0.33 3.50±0.11 3.60±0.34 3.70±0.30骨折組 66 0.2±0.11 0.3±0.22 0.4±0.33 0.5±0.39 0.7±0.40 0.9±0.50 sham 組 66 0.1 0.3 0.4 0.5 0.7 0.9

2.2 基因表達譜芯片實驗

動物SD 大鼠治療組4只（骨折+骨康靈液，2 雌，2 雄，樣品編號A、B、C、D）；對照組4只（骨折，2 雌，2 雄，樣品編號E、F、G、H）。表2 中可見，篩選出上調基因650個，下調基因157個，差異基因總數807個。A vs E 比較，篩選出上調基因2149個，下調基因1418個，差異基因總數3567個，其他的依此類推。

表2 兩組差異基因統計比較

3 討論

骨折愈合是一個相對較為復雜的過程，是骨折斷端間的一種組織修復反應，在這個過程中，有較多的細胞及細胞因子參與其中，并起到協調的作用。而且該過程的實質是骨細胞的再生以及骨折的完全修復，局部骨生長因子在其中起著重要的調控作用，其對于愈合速度和質量意義重大[6-10]，但最終的目標是恢復骨骼的正常結構和功能。如何促進骨折愈合一直是醫學領域的重要課題，中醫藥促進骨折愈合也是中醫骨傷學的一個重要研究方向。

在本研究中，治療組與對照組相比，在造模第7d X 影像學無明顯差異(P＞0.05)，在造模50 天治療組骨痂明顯多于對照組(P＜0.05)。骨康靈液制劑可促使骨痂生長，骨康靈液對骨折愈合有修復作用[11,12]；基因芯片檢測篩選上下調基因結果已經篩選出來了，而目標基因和分子的篩選檢測實驗還在準備中。有待于下一步進一步研究骨康靈液制劑發生療效作用的愈合機制。