HPLC 法分別測定穿心蓮莖、葉中穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯的含量

莊子瑜，于遠洋，董斌

(大連市檢驗檢測認證技術服務中心，遼寧 大連)

0 引言

穿心蓮為爵床科植物Andrographis paniculata(Burm.f.)Nees.的地上部分，有清熱解毒、消腫止痛、涼血等作用，民間用作苦補健胃和抗菌消炎藥。現代研究表明，穿心蓮的主要成分穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯類化合物具有明顯的藥理活性，可用于感冒發熱，咽喉腫痛，口舌生瘡，頓咳勞嗽，泄瀉痢疾，熱淋澀痛，癰腫瘡瘍，蛇蟲咬傷[1]。中國藥典2015年版(一部)穿心蓮項下對穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯進行了含量測定。本文參考文獻，使用藥典方法微調后[2，3]，采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography,HPLC）測定穿心蓮植株不同部位(葉、嫩莖、老莖)中兩者的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters2998 ACQUITY HPLC 系 統 (PDA 檢測 器)，Empower 工作站(Waters 公司)；Diamonsil C18（2）（5μm，4.6×250mm）填料：十八烷基鍵合硅膠；Waters 公司)；Sartorius BP211D、Sartorius BP221S 電子天平(Sartorius 公司)。

1.2 試藥

對照品穿心蓮內酯（批號110797-201609 99.7%），脫水穿心蓮內酯（批號110854-201710 99.4%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，水為超純水。穿心蓮藥材(購自河北亳州藥材市場，經大連市藥檢院中藥室鑒定)。

2 色譜條件及系統適用性試驗

采用Diamonsil C18（2）（5μm，4.6×250mm）色譜柱，以甲醇- 水（50:50）為流動相；檢測波長: 穿心蓮內酯225nm，脫水穿心蓮內酯254nm；流速1.0ml/min；柱溫：35℃；進樣量10μl。

3 溶液配制

3.1 對照品溶液

精密稱取穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml 各含0.1mg 的混合溶液，即得。

3.2 供試品溶液

取穿心蓮藥材，將嫩莖（綠色）、葉、老莖（非綠色）分類后，分別粉碎，過四號篩，分別精密稱取各部位細粉約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入40% 甲醇25ml，稱定重量，浸泡1h，超聲處理（功率250W，頻率33kHz）30min，放冷，再稱定重量，用40%甲醇補足減失的重量。離心（轉速為每分鐘8000 轉）10min，精密量上清液10ml，加在中性氧化鋁柱（200-300 目，5g，內徑為1.5cm）上，用甲醇30ml 洗脫，收集洗脫液，置50ml 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

4 樣品測定

按“3.2”項操作，得供試品溶液。精密吸取供試品溶液10L 注入色譜儀，按上述色譜條件進行測定，結果見表1。

表1 穿心蓮不同部位含量

5 方法學驗證

5.1 線性范圍考察

取穿心蓮內酯對照品10.39mg，分別制成62.15、41.44、20.72、10.36、5.18μg/ml 的溶液，取脫水穿心蓮內酯對照品10.22mg，分別制成20.32、10.16、4.063、2.032、1.016μg/ml 的溶液，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積，結果見表2。

表2 穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯線性范圍考察結果

以進樣量為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程分別為：Y=2120019X-3466 r=0.9999（穿心蓮內酯）和Y=1816518X-3294 r=0.9999（脫水穿心蓮內酯）。

結果表明：穿心蓮內酯在0.05179-0.6215μg 范圍內線性關系良好；脫水穿心蓮內酯在0.01016-0.2032μg 范圍內線性關系良好[4]。

5.2 精密度

考察取同一供試品溶液連續進樣6次，測得穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯峰面積的RSD分別為0.9%、0.9%。結果表明，儀器精密度良好[5]。

5.3 穩定性考察

取同一供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、16 和24h 進樣測定。測得穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯峰面積的RSD分別為0.9%、0.9%。結果表明供試品溶液中上述2個成分在24h 內穩定性良好。

5.4 重復性考察

取同一批供試品，平行制備6 份供試品溶液，測定，記錄各組分色譜峰面積。結果重復性符合要求。

5.5 加樣回收率試驗

采用加樣回收法，精密稱取已知含量的同一批號的樣品共9 份（各0.5g），取每三份為一組，每組分別精密加入含穿心蓮內酯（0.5987mg/ml）及脫水穿心蓮內酯（0.1495mg/ml）的混合對照品各1ml、2ml、3ml，再分別精密加入甲醇50ml，按上述條件操作，計算回收率。測定結果表明方法的準確度較好[6]。

5.6 定量限

測定取同一對照品溶液，用甲醇溶液逐級稀釋，進樣測定。取穿心蓮對照品溶液（0.1657μg/ml），其信號約為噪音信號的10 倍，得檢測限為0.1657μg/ml（即1.657×10-9g）；取脫水穿心蓮對照品溶液（0.3250μg/ml），其信號約為噪音信號的10 倍，得檢測限為0.7663μg/ml（即3.250×10-9g）。

5.7 檢出限

測定取同一對照品溶液，用甲醇溶液逐級稀釋，進樣測定。取穿心蓮對照品溶液（0.08287μg/ml），其信號約為噪音信號的3 倍，得檢測限為0.08287μg/ml（即0.8287×10-9g）；取脫水穿心蓮對照品溶液（0.1625μg/ml），其信號約為噪音信號的3 倍，得檢測限為0.1625μg/ml（即1.625×10-9g）。

6 討論

從穿心蓮藥材的測定結果來看，穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯含量葉中均明顯高于莖；葉中穿心蓮內酯含量約為嫩莖的4.1 倍，約為老莖的21.9 倍；葉中脫水穿心蓮內酯含量約為嫩莖的3.3 倍，約為老莖的26.2 倍；所以藥用穿心蓮的采集使用應以葉多莖少時為佳[7,8]，鑒于安國、亳州藥材市場已將穿心蓮莖葉分開銷售，建議藥典委完善使用穿心蓮藥材的中成藥處方，對穿心蓮投料的莖葉比例作出相關規定。