治療急性胰腺炎的大黃活性成分篩選及其靶基因生物學功能分析

肖丹陽，張玲，趙婧，黃珍珍，李培武

蘭州大學第二醫院，蘭州730030

急性胰腺炎（AP）是常見的消化系統疾病，病因復雜，發病機制多樣，目前研究最為廣泛的發病機制有胰酶自身消化學說、炎癥因子學說、胰腺腺泡內鈣超載學說等，也有一些新觀點引起廣泛關注，如炎癥信號傳導機制激活后引起自噬、溶酶體、線粒體功能障礙等［1］。AP起病急，進展快，當炎癥反應超出機體的抗炎能力時，可引起炎癥擴散，導致全身炎癥反應綜合征（SARS）甚至多器官功能障礙（MODS），病情極度兇險，危及生命。大黃始記載于《神農本草經》［2］，其功效良多，被多種中醫典籍收錄，并一直沿用至今。大黃在AP中的作用已被廣泛研究，有數據表明，大黃可減少胰酶的分泌，改善胰腺微循環［3］，也可促進胃腸蠕動及胃腸道新陳代謝，保護腸道屏障，控制疾病的發展，在臨床上可取得較好的療效［4］。然而，大黃干預AP的相關分子機制尚未被系統闡釋。2020年7–9月，我們通過網絡藥理學挖掘治療AP的大黃有效活性成分，篩選出活性成分靶基因，并探討了靶基因可能的生物學功能及相關信號通路，進一步闡述大黃治療AP的可能作用機制，為后續研究提供相關理論基礎。

1 材料與方法

1.1 數據庫及軟件TCMSP（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）；Uniprot蛋白質數據庫（https：//www.uniprot.org）；GeneCards數據庫（https：//www.gene‐cards.org）；OMIM數據庫（http：//www.omim.org）；DRUGBANK數據庫（https：//www.drug bank.ca）；Metascape平臺（http：//metascape.org/gp/index.ht‐ml）；Cytoscape（版本：3.8.0）。

1.2 大黃活性成分及其靶基因的篩選在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺TCMSP中檢索“大黃”，得到其所包含的化學成分，采用TCMSP數據庫的ADME預測功能，在大黃化學成分庫中篩選大黃活性成分，設定口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18?；贏DME獲得的活性成分，進一步通過TCMSP平臺預測其作用的靶基因。得到的作用靶基因統一在Uniprot蛋白質數據庫進行名稱校正，并刪除重復基因，即得到大黃活性成分靶基因。

1.3 AP發病相關基因篩選以“acute pancreatitis”為關鍵詞分別在GeneCards數據庫、OMIM數據庫［5］、DRUGBANK數據庫中檢索AP發病相關基因，GeneCards數據庫中基因與疾病的聯系緊密程度與Score值呈正相關，若基因過多，可篩選Score大于中位數的基因作為疾病潛在相關基因，篩選結束后合并3個數據庫所獲得的AP發病相關基因，并刪除重復值。

1.4 治療AP的大黃活性成分關鍵靶基因篩選利用R語言將二者（藥物活性成分靶基因與AP相關靶基因）取交集并繪制維恩圖，從而確定大黃活性成分關鍵靶基因。

1.5 大黃活性成分關鍵靶基因生物學功能及信號通路分析將大黃活性成分關鍵靶基因利用Metascape平臺進行GO富集分析和KEGG通路富集分析。其中GO富集分析涵蓋分子功能（MF），細胞組分（CC）和生物過程（BP）三個部分。

2 結果

2.1 大黃活性成分及其靶基因、關鍵靶基因在TCMSP數據庫中檢索“大黃”，得到活性成分92個，基于TCMSP數據庫的DL、OB參數共篩選出活性成分16個（表1），主要包括β-谷甾醇、蘆薈大黃素等，通過TCMSP數據庫預測大黃活性成分潛在作用靶基因，刪除重復項后得到58個大黃潛在作用靶基因，主要靶基因有NCOA2、PTGS2、PIK3CG、BCL2、BAX等。

最終獲得與AP發病相關的基因1 153個。利用R語言相映射篩選關鍵靶基因共30個，分別為NCOA2、PTGS2、PIK3CG、CHRM3、CHRM1、CHRM4、CHRM2、ADRB2、SLC6A4、BCL2、BAX、CASP9、JUN、CASP3、CASP8、TGFB1、PON1、NOS2、ESR1、CHEK1、PPARG、F7、DPP4、PRSS1、KDR、CDKN1A、TNF、TP53、MYC、IL1B。

2.2 大黃活性成分關鍵靶基因的生物學功能及信號通路關鍵靶基因涵蓋CC 29條，BP 798條，MF 44條，GO生物學功能主要涉及膜筏、膜微域、膜域等細胞組分；藥物反應、凋亡信號通路、細胞對氮化合物的反應、對氧氣水平的反應、對非生物以及生物刺激的反應、對細胞增殖的負調控等生物過程；G蛋白偶聯乙酰膽堿受體活性、蛋白質結構域特異性結合、G蛋白偶聯胺受體活性、乙酰膽堿受體活性等分子功能。

30個關鍵靶基因參與75條相關通路，根據P值篩選前20條通路見表2，包括癌癥信號通路、細胞凋亡、p53信號通路、IL-17信號通路、PI3K-Akt信號通路等。

表1 大黃潛在有效成分

3 討論

大黃最早記載于《神農本草經》：“主下瘀血，血閉，寒熱，破癥瘕積聚，留飲，宿食，蕩滌腸胃，推陳致新，通利水谷，調中化食，安和五臟”。大黃功效良多，其調節胃腸道功能、保護心腦血管、保肝利膽、抗炎、免疫調節等作用已得到廣泛研究。AP發病急，進展快，目前臨床治療仍缺乏特異性藥物，以對癥支持治療為主。越來越多的研究表明，中藥治療AP在緩解癥狀、降低病死率方面已取得顯著療效。翁文輝等［6］在研究中發現，重癥AP（SAP）患者的治療中加用大黃可有效提高治療效果，并可降低病死率。大黃也可在AP引起的腸道機械屏障、生物屏障、免疫屏障障礙中起保護作用，進一步對腸道屏障功能障礙引起的MODS起到一定防治作用［7-9］。

表2 大黃-AP靶點通路富集結果

本研究利用網絡藥理學探究大黃對AP的作用機制，通過中藥系統藥理學數據庫篩選出16個大黃活性成分，以及58個作用靶基因，其中30個關鍵靶基因與AP相關。篩選出的大黃活性成分中，β-谷甾醇、蘆薈大黃素等均可能對AP的治療起重要作用。已有研究證實，以角叉菜膠誘導大鼠足水腫后，無論口服給藥或腹腔給藥，β-谷甾醇均能表現出顯著的抗炎作用［10］。然而，β-谷甾醇對AP的治療作用以及作用機制還有待于進一步研究。蘆薈大黃素可顯著降低AP大鼠血清中PAF、IL-6以及TNF-α水平，抑制炎癥反應的發展［11］。此外，本研究結果顯示，CASP3、BAX、BCL2等基因為大黃治療AP的主要靶基因。周新澤等［12］的一項研究表明，在急性水腫型胰腺炎與急性壞死型胰腺炎大鼠模型中應用大黃素治療后，胰腺組織病理學損害顯著減輕，同時胰腺組織BAX mRNA表達量增加，說明大黃素可通過影響BAX表達誘導胰腺細胞凋亡，從而減緩病情進展。王悅等在研究中發現，大黃素可能通過誘導SAP中性粒細胞Caspase-3的表達促進中性粒細胞凋亡，進一步限制炎癥反應的發展。大黃多糖可上調BCL2表達，減少BAX的表達，使BCL2/BAX比例上調，Caspase-3活化被抑制，進而抑制腸道上皮細胞凋亡、保護腸道屏障功能。KEGG通路富集分析結果表明，細胞凋亡、p53信號通路、IL-17信號通路、PI3K-AKT信號通路等在大黃治療AP過程中可能發揮重要作用。已有大量研究證實，誘導胰腺腺泡細胞凋亡可顯著減慢AP的進展。SAP大鼠中性粒細胞可出現凋亡延遲現象，應用大黃素后可抑制中性粒細胞凋亡，從而減緩病情發展［13］。石占利等［14］在其研究中也得出相同的結論。p53基因為凋亡相關基因，AP患者應用大黃后可引起p53表達量的增多從而誘導胰腺細胞凋亡，影響病情發展。大黃通過PI3K-AKT信號通路對AP的保護作用也得到證實，ZHAO等［15］在AR42J細胞外分泌模型中的研究數據表明，大黃酸可通過上調AR42J細胞中PI3K、AKT、mTOR的表達抑制AMPK的活性，進而對AP過程中受損的線粒體起保護作用。阻斷AP過程中的IL-17途徑可減少促炎細胞因子的釋放，減輕炎癥反應［16］。輔助T細胞17（Th17）可介導炎癥反應，促進IL-17、TNF-α、IL-8等多種促炎因子的分泌，而調節性T細胞（Tregs）主要分泌IL-10和TGF-β等抑炎因子。Treg與Th17相互制約，維持機體免疫平衡，在免疫調節中發揮重要作用［17］。SAP過程中可出現Treg/Th17失衡［18］，而大黃素可改善失衡狀態從而減輕胰腺損傷［17］。

綜上所述，治療AP的大黃活性成分包括β-谷甾醇、蘆薈大黃素等，活性成分靶基因主要有NCOA2、PTGS2、PIK3CG、BCL2、BAX等；關鍵靶基因主要參與藥物反應、凋亡信號通路、細胞增殖負調控等生物學過程，相關通路主要有細胞凋亡、IL-17等信號通路。本研究通過網絡藥理學分析大黃治療AP的可能機制，通過分析得出，大黃相關活性成分可能通過細胞凋亡、抗炎癥反應等途徑實現其對AP的治療作用。大黃治療AP的主要靶基因及通路為其作用機制的實驗研究奠定了理論基礎。