殼聚糖基醫用補片的制備及其性能研究

劉大慶 高嵩巍 馬建偉 陳韶娟

1.青島大學紡織服裝學院，山東 青島266071；2.江蘇豐裕紡織科技有限公司，江蘇 南通226010

目前，隨著醫學和生物材料的不斷發展，醫用補片在修復人體部位缺陷，如疝氣修補、胸壁重建、心包修復、女性盆底重建、腎固定和硬腦膜修補等領域有著廣泛的應用[1]。用作醫用補片的材料有很多，如根據材料的性質可分為合成材料[2]、生物材料和復合材料等[3-4]。合成補片具有良好的堅韌度和生物惰性，在臨床腹壁缺損修補方面應用較多，但使用過程中存在因補片皺縮而引發慢性疼痛及感染等問題[5]。生物補片具有優良的抗感染性，且安全、無毒、可吸收，生物和組織相容性較好，應用前景廣闊[6]。復合補片可以實現單一補片難以達到的理想狀態，并發揮各自的優點，進而保證在修復過程中組織生長良好，并有效地減少粘連的發生。

殼聚糖(CS)是甲殼素脫乙酰化的產物[7]，屬天然的高分子生物材料，在動植物體內及真菌細胞體內大量存在[8]。羧甲基化殼聚糖(CMC)是在殼聚糖分子鏈上引入羧基而形成的一種衍生物，具有良好的抑菌、抗氧化和止血等功能，其水溶性和重金屬螯合作用優于殼聚糖[9-10]。因此，具有良好的生物相容性和可降解性的殼聚糖及殼聚糖基衍生物成為了醫學領域常用的生物材料[11]。

殼聚糖具有良好的成膜性，目前多采用傳統的延流法制備殼聚糖膜。本文將以完整的梭子蟹蟹殼為原料，在維持梭子蟹蟹殼原有形態的基礎上，依次對梭子蟹蟹殼進行預處理，以及浸酸脫鈣質、堿煮脫蛋白和濃堿脫乙酰化處理，制備性能優良且完整的殼聚糖膜；然后，以殼聚糖膜為基材，進一步采用氯乙酸法對殼聚糖膜進行羧甲基化處理，制備羧甲基化殼聚糖膜；最后，探究殼聚糖膜和羧甲基化殼聚糖膜的性能，以期為殼聚糖基醫用補片的應用提供參考。

1 材料與儀器

1.1 主要材料與試劑

梭子蟹蟹殼(國產)，鹽酸(天津市富宇精細化工有限公司)，NaOH(天津市北方天醫化學試劑廠)，異丙醇(上海沃凱生物技術有限公司)，無水乙醇(天津市富宇精細化工有限公司)，氯乙酸(天津市大茂化學試劑廠)，蒸餾水(青島盛天義生物有限公司)。

1.2 主要儀器

FA2204B型電子天平(上海天美天平儀器有限公司)，101-2型鼓風干燥箱(上海市實驗儀器總廠)，SHZ-82型水浴恒溫振蕩器(金壇市實驗儀器廠)，HTX-12P型紅外線小樣染色機(江蘇市華夏科技有限公司)，PHS-2C型雷磁pH酸度計(上海市理達儀器廠)，XG-CAM型接觸角測量儀(上海軒鐵創析工業設備有限公司)。

2 殼聚糖膜和羧甲基化殼聚糖膜的制備

2.1 殼聚糖膜的制備

對梭子蟹蟹殼依次進行預處理、浸酸脫鈣質、堿煮脫蛋白和濃堿脫乙酰化處理。

預處理，即將梭子蟹蟹殼放在蒸餾水中清洗干凈，去除表面雜質；浸酸脫鈣質，即將預處理的梭子蟹蟹殼在溫度為25 ℃、體積分數為7%的鹽酸溶液中處理24 h；堿煮脫蛋白，即使用質量分數為5%的NaOH溶液在60 ℃條件下對脫鈣質后的梭子蟹蟹殼處理4 h；濃堿脫乙酰處理，即采用質量分數為50%的NaOH溶液分別在120、125和130 ℃的條件下對堿煮脫蛋白后的梭子蟹蟹殼處理1.0、1.5和1.5 h，后經超聲清洗和鼓風干燥箱干燥，得到殼聚糖膜備用。

2.2 羧甲基化殼聚糖膜的制備

殼聚糖膜的羧甲基化主要包含溶脹、堿化和羧甲基化這3個步驟。溶脹是在室溫條件下，將1.0 g制備的殼聚糖膜放入100 mL異丙醇和蒸餾水的混合溶液中反應1 h，其中異丙醇和蒸餾水的體積比為8∶2；接著，將溶脹的殼聚糖膜與質量分數為40%的NaOH溶液在40 ℃的條件下反應4 h，完成堿化過程；然后，向該反應體系中加入15 mL的氯乙酸/異丙醇溶液(氯乙酸與異丙醇質量比為1∶1)，在60 ℃的條件下充分反應，完成殼聚糖的羧甲基化，再經醇洗干燥，獲得羧甲基化殼聚糖膜備用。

3 羧甲基化取代度的測定

本試驗先稱取0.1 g制備的羧甲基化殼聚糖膜，溶解于20 mL、0.1 mol/L的HCl標準溶液中；然后，配置一定量的0.1 mol/L的NaOH標準溶液，每次向HCl標準溶液中滴入1 mL NaOH標準溶液進行滴定，并用PHS-2C型雷磁型pH計(配有E-201-C型pH復合電極)測試pH值的變化，記錄NaOH標準溶液體積(mL)與pH值的對應關系，獲取電位滴定曲線；最后，根據電位滴定曲線得到滴定終點，再根據式(1)和式(2)分別計算得到羧甲基化取代度kDS[14]。

(1)

(2)

式中：n——單位質量羧甲基化殼聚糖膜中羧甲基物質的量，mol/g；

c——NaOH標準溶液的濃度，mol/L；

V1——滴定HCl標準溶液時消耗的NaOH標準溶液的體積，mL；

V2——滴定—CH2COOH時消耗的NaOH標準溶液的體積，mL；

m——羧甲基化殼聚糖膜的凈質量，g。

4 殼聚糖膜及羧甲基化殼聚糖膜基本性能的測試

在醫學領域，理想的醫用補片應理化性能穩定，具有良好的生物相容性，使用后無炎癥和排斥反應；同時應具有良好的溶脹性、吸水性、潤濕性及抗菌性等，以便實現傷口處組織液較快吸收，促進組織愈合和增生。本文將就殼聚糖膜及羧甲基化殼聚糖膜的溶脹性、吸水性、潤濕性及抗菌性展開測試。

4.1 溶脹性

將殼聚糖膜和羧甲基化殼聚糖膜干燥至恒定質量，裁剪成1 cm×1 cm的試樣各3份。先分別稱量并記錄試樣的初始質量m0(g)；再分別將試樣浸入pH值為7.4的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，室溫靜置 20 h，將試樣取出，用濾紙吸去試樣表面水分后稱取溶脹后的試樣質量m1(g)。根據式(3)計算兩種試樣各自的溶脹率(kSI)：

(3)

最終試樣的溶脹率取各自測試結果的平均值。

4.2 吸水性

室溫下，各準備3份一定面積的殼聚糖膜試樣和羧甲基化殼聚糖膜試樣浸于蒸餾水中，6 h后取出，用濾紙吸去各自表面的水分，稱取各自的質量并記錄為m′1(g)，然后將試樣放入鼓風干燥箱中干燥后稱取各自的質量記為m′0(g)。根據式(4)計算兩種試樣各自的吸水率(Q)：

(4)

最終試樣的吸水率取各自測試結果的平均值。

4.3 潤濕性

使用XG-CAM型接觸角測量儀獲取殼聚糖膜試樣和羧甲基化殼聚糖膜試樣的靜態接觸角圖像與靜態接觸角數值，以分析殼聚糖膜和羧甲基化殼聚糖膜的表面潤濕性能。

具體操作：首先將殼聚糖膜和羧甲基化殼聚糖膜裁剪成平整的小片并固定在玻璃片上，調整好玻璃片在實驗臺上的位置，將0.2 μL的蒸餾水滴加在小片的表面，此時可以從計算機圖像中看到一個清晰的小液滴，3 s時凍結圖像將畫面固定，然后讀取圖像中的靜態接觸角數值。

4.4 抗菌性

采用傳統細菌培養、接種的方法進行抗菌性測試。分別稱取0.3 g的殼聚糖膜試樣和羧甲基化殼聚糖膜試樣，在完成培養基配制、試樣滅菌處理、菌液配制及試樣接種工序后，在其他條件完全相同的情況下，分別將含有殼聚糖膜試樣與羧甲基化殼聚糖膜試樣的燒瓶及對照組空燒瓶放于水浴恒溫振蕩器中振蕩接觸18 h，最后測試燒瓶中大腸埃希菌的細菌濃度。根據式(5)計算試樣對大腸埃希菌的抑菌率R(%)：

(5)

式中：x——對照組振蕩接觸后燒瓶內大腸埃希菌的濃度均值，CFU/mL；

y——試樣振蕩接觸后燒瓶內大腸埃希菌的濃度均值，CFU/mL。

5 結果與分析

5.1 羧甲基化取代度

利用電位滴定法得到羧甲基化殼聚糖膜的電位滴定曲線如圖1所示。

圖1 羧甲基化殼聚糖膜的電位滴定曲線

由文獻[15]可知，堿性條件下，羧甲基會在—OH和—NH2上發生取代反應，且在—OH上的取代多于在—NH2上的取代。kDS<1.00時，表明羧甲基的取代主要發生在—OH上，生成了O-羧甲基化殼聚糖；kDS≥1.00時，表明羧甲基的取代在—OH和—NH2上同時發生，生成了O，N-羧甲基化殼聚糖[16]。

在羧甲基化殼聚糖膜的制備過程中，NaOH和氯乙酸的用量均會對羧甲基化有較大的影響[17]。殼聚糖具有較高的結晶度，反應前需提前進行堿化，以便氯乙酸進入并與之充分反應。當氯乙酸用量過低時，羧甲基化取代反應不徹底；當氯乙酸用量過高時，氯乙酸的利用率會降低。李東華[18]考查了氯乙酸用量、NaOH用量、反應溫度和反應時間這4個因素的影響，設計了4因素3水平的正交試驗，發現當m(殼聚糖)∶m(NaOH)∶m(氯乙酸)=1.0∶4.5∶1.4時，可制得kDS=1.21的羧甲基化殼聚糖膜。

本試驗設定m(殼聚糖)∶m(NaOH)∶m(氯乙酸)=1.0∶20.0∶15.0，足量的氯乙酸能夠滲入殼聚糖膜的結晶區中充分反應，使堿化更充分，所制備的羧甲基化殼聚糖膜的取代度為1.86(>1.00)，生成的是O，N-羧甲基化殼聚糖。

5.2 溶脹性和吸水性

溶脹性和吸水性是影響醫用補片性能的重要因素。從本質而言，補片的吸水性和溶脹性與材料本身的結晶度和分子鏈上的親水基團有關。材料的結晶度越高，則其內部分子排列越規整有序，水分子越難以進入，故其吸水率和溶脹率越低。反之，材料的結晶度越低，則其吸水率和溶脹率越高[19]。

殼聚糖膜試樣和羧甲基化殼聚糖膜試樣的溶脹率和吸水率結果如圖2和圖3所示。

圖2 殼聚糖膜試樣和羧甲基化殼聚糖膜試樣的溶脹率

圖3 殼聚糖膜試樣和羧甲基化殼聚糖膜試樣的吸水率

由圖2和圖3可以看出：與殼聚糖膜試樣相比，羧甲基化殼聚糖膜試樣的溶脹率和吸水率顯著提高，這表明后者在醫學應用時更有利于對傷口部位滲出液的吸收，為傷口的愈合提供一個干燥的環境，并有利于抑制傷口部位細菌的滋生。

5.3 潤濕性

殼聚糖膜試樣和羧甲基化殼聚糖膜試樣的靜態接觸角均值如圖4所示。

圖4 殼聚糖膜試樣和羧甲基化殼聚糖膜試樣的靜態接觸角均值

由圖4可以看出：羧甲基化殼聚糖膜試樣的親水性更顯著，表明其潤濕性更好，這與其吸水率測試結果一致。

5.4 抗菌性

采用10倍稀釋法，分別將對照組燒瓶中的菌液、含有殼聚糖膜試樣和含有羧甲基化殼聚糖膜試樣的菌液稀釋3次后，各吸取1mL菌液置于培養皿上，于恒溫培養箱中培養24 h，觀察培養皿上大腸埃希菌菌落的生長情況(圖5)。

a) 對照組菌液

再采用平板計數法計算各平板中細菌的數量，通過式(5)計算殼聚糖膜試樣與羧甲基化殼聚糖膜試樣的抑菌率，結果如表1所示。

表1 殼聚糖膜與羧甲基化殼聚糖膜的抑菌率

由表1可知，殼聚糖膜試樣對大腸埃希菌的抑菌率高達99.0%，抑菌效果顯著。殼聚糖膜中含有大量的氨基，在酸性條件下部分氨基質子化以—NH3+的形式存在，可與細菌的細胞膜發生作用，從而起到抑菌的作用。羧甲基化殼聚糖膜對大腸埃希菌的抑菌率為33.9%，有一定的抑菌效果，但與殼聚糖膜相比其抗菌性較低，原因可能與羧甲基化殼聚糖膜的取代度較高，導致能與細菌細胞膜結合的—NH3+減少有關。

6 結論

本文以梭子蟹蟹殼為原料，經稀鹽酸和稀堿處理后，去除梭子蟹蟹殼中的鈣質和蛋白質等物質，得到甲殼素膜，再經過濃堿脫乙酰化后制得殼聚糖膜，最后殼聚糖膜在低溫堿性條件下和氯乙酸發生取代反應，制得了高取代度(kDS=1.86)的羧甲基化殼聚糖膜。

由溶脹性、吸水性、潤濕性及抗菌性的測試結果可知，羧甲基化殼聚糖膜具有較好的溶脹性、吸水性和潤濕性，對大腸埃希菌具有一定的抗菌性。總體而言，羧甲基化殼聚糖膜在醫用補片領域的應用具有廣闊的前景，關于其抑菌性能有待做進一步的探索。