五種農藥及其二元、三元組合對人肝癌HepG2細胞的聯合毒性

王天彩, 陳 晨, 馬朦朦, 楊 茜, 李 耘, 錢永忠

(中國農業科學院 農業質量標準與檢測技術研究所，北京 100081)

農藥在農業生產及農業環境保護中起到重要的作用[1]。中國農藥年用量183萬噸，農藥市場銷售額僅居于巴西、美國、日本、法國之后，占全球5.23%[2]。但目前使用的許多農藥都具有相當的持久性和毒性，加之存在使用不當等現象，農藥在不同基質中的檢出和超標現象已引起人們的廣泛關注[3-5]。Hvězdová 等對捷克共和國75個耕地土壤中的53種農藥和15種轉化產物進行了檢測分析，檢出率高達98.7%[6]。農藥品種繁多，復配農藥占很大比例，多種農藥混合使用、盲目使用或者濫用致使農產品中多農藥殘留現象比較突出。Lozowicka等在測定波蘭水果中的農藥殘留時發現，64.2%的樣本中含有可檢出的農藥殘留，其中13%的樣本農藥含量超過歐盟規定的最高殘留限量 (MRL)，高達46.3%的樣本中含有2～8種農藥殘留[7]。Fosu和Bakirci等分別對2010—2012年間加納和土耳其果蔬中的農藥含量進行監測。結果顯示，多農藥殘留樣本分別高達88.40%和20.03%，顯著高于32.40%和9.21%的超標樣本[8-9]。由此可見，相對于農藥超標，農藥多殘留現象更不容忽視，農藥多殘留帶來的安全隱患更是不容小覷。

農藥能夠殺死、擊退或抑制生物生長[10]。一些農藥不僅針對一類害蟲，對其他生物也具有相當的毒性。殘留的農藥會被部分生物攝入或者通過其他方式吸入，并在體內積累，再通過食物鏈轉移到其他生物體內，最終進入人體[11]。農藥暴露會對人體產生肝臟、神經、免疫、基因等毒性，一些農藥還具有內分泌干擾效應[12-16]。混合農藥各組分之間可能產生生物學效應，呈現十分復雜的交互作用。Du等應用血漿代謝組學評估了敵敵畏、高滅磷、樂果及甲拌磷4種有機磷農藥對雄性Wistar大鼠的毒性作用。結果表明，4種藥物在對大鼠無損害作用水平下混合可產生聯合效應，會引起機體氧化應激和肝腎功能障礙[17]。綜上所述，多農藥殘留可能產生復雜的聯合毒性效應，但目前國內外在制定農藥限量標準時往往僅考慮單一或一類農藥的危害，而忽略了混合污染帶來的聯合毒性問題[18-20]。因此，評估多農藥殘留的潛在聯合毒性和量化風險，成為環境科學家、風險評估人員和監管機構面臨的主要挑戰。

肝臟是外源性物質代謝的重要場所，其中人肝癌HepG2細胞是一種用于毒性研究的模型細胞株，常用于藥物代謝和肝毒性研究[21-22]。CCK-8(Cell Counting Assay Kit-8) 法由于其卓越的靈敏度和便捷的操作，已廣泛用于藥物的細胞毒性評估[23-25]。基于近幾年國家食品及農產品質量安全風險監測和風險評估數據，本研究以生菜中殘留的苯醚甲環唑、氯氰菊酯、烯酰嗎啉、氯氟氰菊酯和啶蟲脒5種農藥及其典型二元、三元混合物為研究對象，采用CCK-8法探究農藥單劑及混合物對HepG2細胞的增殖抑制毒性，應用濃度相加(concentration addition，CA)、獨立作用 (independent action，IA) 和聯合指數 (combination index，CI) 模型，通過單個農藥的細胞毒性作用推導出混合物聯合效應，進一步探究農藥混合物對細胞凋亡的誘導作用。其中典型二元組合包括烯酰嗎啉 + 苯醚甲環唑、烯酰嗎啉 + 氯氰菊酯和烯酰嗎啉 + 啶蟲脒；典型三元組合包括烯酰嗎啉 + 苯醚甲環唑 +氯氰菊酯、烯酰嗎啉 + 苯醚甲環唑 + 氯氟氰菊酯及烯酰嗎啉 + 氯氰菊酯 + 啶蟲脒。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

98.7%烯酰嗎啉(dimethomorph)、97.2%苯醚甲環唑( difenoconazole)、94.3%氯氰菊酯(cypermethrin)、98.3%氯氟氰菊酯(cyhalothrin)和97.8%啶蟲脒(acetamiprid)農藥標準品 (德國Dr. Ehrenstorfer公司)；DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) 培養基、胎牛血清、胰蛋白酶 (0.25 Trypsin-EDTA)、磷酸鹽緩沖液 (PBS)、青霉素-鏈霉素溶液和0.4%臺盼藍染液 (美國Thermo Fisher公司)；CCK-8試劑盒 (Dojindo日本同仁化學公司)；細胞凋亡試劑盒 (美國BD-Pharmingen公司)；Hoechst染料 (美國Invitrogen公司)；二甲基亞砜 (DMSO)(美國Sigma公司)。

CKX41SF倒置顯微鏡 (奧林巴斯中國有限公司)；M200 PRO多功能酶標儀 (美國TECAN公司)；Thermo Forma 311直熱式二氧化碳恒溫培養箱 (美國Thermo Fisher公司)；HHS電熱恒溫水浴鍋 (上海博迅實業有限公司醫療設備廠)；IKAMS3 渦旋振蕩器 (德國IKA公司)；TDZ4-WS低速自動平衡離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)；IC1000 Countstar全自動細胞計數儀 (美國Countstar公司)；OPRT1168高內涵篩選系統 (美國PerkinElmer公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞培養 HepG2細胞使用DMEM培養基(添加10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗)，在37 ℃、飽和濕度及5% CO2條件下進行恒溫培養。當細胞鋪滿培養瓶底面積約至90%時，用胰蛋白酶進行消化，以1: 2的比例進行傳代。

1.2.2 染毒液配制 在超凈臺中，將農藥標準品用DMSO稀釋成一定濃度的母液，用不含血清的培養基逐級稀釋至所需濃度用于后續試驗，其中保證DMSO最終含量小于0.1%。混合物中各組分聯合暴露方式為等毒性效應暴露。

1.2.3 細胞活力測定 調整細胞密度至每毫升3 ×105個細胞，在96孔板中每孔加入100 μL細胞懸液，在培養箱中培養24 h后，將舊培養液吸出換為不同濃度的染毒液，繼續孵育24 h。向每孔中加入10 μL CCK-8溶液，孵育1 h后用酶標儀測定其在450 nm處的吸光度。按 (1) 式計算抑制率 (I)。

(1)式中：As為處理孔吸光值 (含有細胞和毒性物質的培養基)；Ab為對照孔吸光值 (含有細胞、沒有毒性物質的培養基)；Ac為空白孔吸光值(不含細胞和毒性物質的培養基)。

1.2.4 基于CA、IA和CI模型的聯合毒性效應評估 目前，國際上廣泛認可的混合物聯合毒性評估模型主要有CA和IA模型[26-27]。CA模型基于混合物成分具有相同或相似的作用模式的假設，通過公式 (2) 計算[26]。

(2)式中：ECx,mix是引起x%效應時的混合物濃度；ECx,i為第i個成分單獨存在并引起與混合物相同的效應x%時的濃度；pi為第i個成分在混合物中的相對質量比。

IA模型是基于混合物中各組分具有不同的作用模式的假設，計算公式為 (3)[26]。

(3)式中：cmix和E(cmix)分別是混合物的總濃度和總效應；E(ci)表示第i個成分對混合物中ci濃度的影響。

Chou等通過多年的理論研究與實驗驗證，提出了基于半數效應方程但不依賴于作用模式的CI模型來評估混合物毒性相互作用，并已廣泛地應用于藥物組合研究[28]。基于藥物半數效應濃度(median effective concentration，EC50) 選擇5個濃度梯度 (0.25 × EC50、0.5 × EC50、EC50、2 × EC50和4 × EC50) 等毒性配比組成聯合藥物體系，評估混合藥物相互作用的類型及程度，計算方法見 (4) 式[27]。

(4)式中：ECx,mix為混合物產生x%效應時的濃度；ECx,i為第i個成分單獨存在并引起與混合物相同的效應x%時的濃度；pi為混合物中第i個組分的相對質量比；CIxcomp是根據混合物的實驗毒性曲線計算出的混合物在x%效應水平下的組合指標值。CI ＜ 1，CI = 1和CI ＞ 1分別表示協同作用，相加作用和拮抗作用。當混合物發生協同作用時，可計算出每個農藥單劑的劑量減少指數(dose reduction index，DRI)。DRI衡量的是在給定的效應水平上與單獨使用每種農藥的劑量相比，協同組合中每種農藥的劑量可減少的倍數[29-30]。

1.2.5 細胞凋亡毒性實驗 為探究各農藥單劑和混合物對細胞凋亡的影響，基于細胞增殖毒性實驗結果，選取各農藥單劑的0.25 × EC50、0.5 ×EC50和EC50值作為凋亡實驗暴露濃度。采用標記異硫氰酸熒光素 (fluorescein isothiocyanate，FITC)的Annexin V作為熒光探針與碘化丙啶 (propidium iodide，PI)、Hoechst染料聯合使用，利用高內涵篩選系統進行檢測，以測定農藥單劑及混合物對細胞凋亡的影響[31-32]。操作方法為：調整細胞密度至每毫升3 × 105個細胞，在96孔黑板中每孔加入100 μL細胞懸液，先將培養板在培養箱中培養24 h，再將舊培養液吸出換為不同濃度的染毒液，繼續孵育24 h。用PBS將FITC染料稀釋10倍、PI和Hoechst染料稀釋1 000倍后組成混合染料，每孔加入100 μL，37 ℃孵育20 min，PBS清洗3遍后進行高內涵掃描。所有操作均在避光條件下進行。

1.2.6 數據處理 使用SPSS分析并處理數據，將結果表示為平均值 ± 標準差。通過Origin 9.1和Excel軟件繪制圖表，并應用CompuSyn軟件分析混合農藥聯合毒性效應。

2 結果與分析

2.1 農藥單劑及組合對HepG2細胞增殖毒性的影響

農藥單劑及混合物對HepG2細胞增殖抑制毒性的劑量-效應曲線如圖1所示。在24 h內，所有農藥單劑及二元組合對HepG2細胞增殖的抑制作用隨農藥濃度的增大呈S型曲線變化，而細胞增殖抑制率先迅速升高，之后緩慢升高 (圖1A-B)。基于劑量-效應曲線擬合出5種農藥單劑的EC50值，其中苯醚甲環唑的增殖抑制毒性最強，EC50值為 (24.72 ± 4.29) μmol/L，其余農藥的毒性順序為：烯酰嗎啉 ((38.14 ± 2.08) μmol/L) ＞ 氯氟氰菊酯 ((43.04 ± 1.65) μmol/L) ＞ 啶蟲脒 ((74.27 ± 5.77)μmol/L) ＞ 氯氰菊酯 ((127.88 ± 4.07) μmol/L)。在烯酰嗎啉 + 苯醚甲環唑 + 氯氰菊酯和烯酰嗎啉 + 氯氰菊酯 + 啶蟲脒2種三元組合聯合暴露模式下，隨著農藥混合物濃度的增大，其對HepG2細胞增殖的抑制作用逐漸增強，表現為明顯的劑量-效應關系 (圖1C)。當聯合暴露農藥濃度在60 μmol/L以下時，隨著烯酰嗎啉 + 苯醚甲環唑 + 氯氟氰菊酯組合農藥濃度增大，HepG2細胞的增殖抑制率并未出現明顯降低，但隨著農藥濃度增大，該農藥組合對 HepG2 細胞增殖的抑制作用呈現先迅速升高，至150 μmol/L后再緩慢升高的趨勢。

2.2 農藥組合對細胞增殖毒性聯合效應評估

2.2.1 CA、IA和CI模型對農藥聯合毒性的預測

圖2顯示CA、IA和CI模型預測以及試驗測得劑量-效應曲線。比起CA和IA模型，在混合農藥毒性預測方面，CI模型預測值更接近實驗測定值。因此CI方法能夠更準確地預測混合物的毒性。

2.2.2 基于CI模型的聯合效應評估 為探究農藥組合之間相互作用類型 (協同作用、拮抗作用或相加作用)，根據CI模型評估農藥組合對細胞增殖毒性效應和CI指數之間的關系。結果 (圖3) 表明，在試驗濃度范圍內，所有二元組合在低效應區呈拮抗作用，高效應區呈協同作用；三元組合烯酰嗎啉 + 苯醚甲環唑 + 氯氟氰菊酯在整個濃度范圍內表現為拮抗作用，而烯酰嗎啉 + 苯醚甲環唑 + 氯氰菊酯和烯酰嗎啉 + 氯氰菊酯 + 啶蟲脒聯合效應為低濃度協同、高濃度拮抗。

如圖4所示：當效應水平為60%時，烯酰嗎啉 + 苯醚甲環唑 + 氯氰菊酯混合物聯合效應從協同轉為拮抗；同樣地，當效應水平為18%時，烯酰嗎啉 + 氯氰菊酯 + 啶蟲脒混合物聯合效應從協同轉為拮抗。

為量化混合農藥之間的協同作用，對低毒性效應10%、20%水平下三元混合物中各組分的DRI值進行分析。如表1所示，對于烯酰嗎啉 +苯醚甲環唑 + 氯氰菊酯和烯酰嗎啉 + 氯氰菊酯 +啶蟲脒，10%毒性水平下各農藥單劑DRI值范圍在3.36～35.82之間。其中農藥單劑氯氰菊酯的DRI值顯著高于其他農藥，說明上述兩個三元組合表現出協同效應時，起決定性作用的農藥單劑是氯氰菊酯。在20%毒性水平下，三元組合烯酰嗎啉 + 苯醚甲環唑 + 氯氰菊酯CI值為0.63，聯合作用為協同效應，各農藥單劑DRI值范圍在3.25～6.99之間；而烯酰嗎啉 + 氯氰菊酯 + 啶蟲脒混合物CI值為1.43，表現為拮抗效應，其中3種農藥烯酰嗎啉、氯氰菊酯和啶蟲脒的DRI值分別是1.88、4.04和1.54，表明啶蟲脒在三元混合物中毒性較弱。

表1 三元農藥組合對HepG2細胞增殖抑制毒性的聯合作用Table 1 The combined effects of ternary mixtures on HepG2 cell growth inhibitory toxicity

2.3 農藥單劑及組合對HepG2細胞凋亡的影響

空白組及苯醚甲環唑在EC50值濃度誘導處理下的HepG2細胞高內涵熒光成像結果如圖5A所示。與空白組相比，苯醚甲環唑單獨處理組表現出明顯的細胞凋亡誘導作用 (P＜ 0.01)，當濃度為24.72 μmol/L時，細胞早期凋亡率高達90.11%，晚期凋亡率高達19.20%。如圖5B所示，其余農藥單劑同樣可以造成HepG2細胞凋亡率顯著提高(P＜ 0.01)，濃度越高，誘導作用越強，呈劑量依賴性。三元組合烯酰嗎啉 + 苯醚甲環唑 + 氯氰菊酯、烯酰嗎啉 + 氯氰菊酯 + 啶蟲脒與空白組相比同樣表現出顯著的凋亡誘導作用。隨著藥物濃度增大，烯酰嗎啉 + 苯醚甲環唑 + 氯氰菊酯對HepG2細胞的凋亡毒性明顯增強，即該農藥組合對HepG2細胞凋亡的誘導作用表現出明顯的劑量-效應關系。對于三元組合烯酰嗎啉 + 氯氰菊酯 + 啶蟲脒，在20.02～80.10 μmol/L濃度范圍內，其誘導凋亡水平對比于農藥單劑顯著提升 (P＜ 0.01)，表現出協同效應，這與CI模型預測的混合物聯合效應相同。

3 結論與討論

近年來，農產品中多種農藥共存的現象頻繁出現，因其可能會產生難以預測的毒性效應而引起人們的廣泛關注。本研究測定生菜中高頻檢出的農藥混合物在HepG2細胞內的毒性，以確定它們在體外相互作用的性質。CCK-8測定結果表明，不同農藥對細胞存活率的影響存在較大差異，其中苯醚甲環唑具有最強的增殖抑制毒性。Zhuang等研究結果同樣證明苯醚甲環唑可以劑量依賴的方式強烈地影響HepG2細胞的存活率[33]。苯醚甲環唑是一種廣譜性的三唑類殺菌劑，廣泛應用于各種農作物[34]，但其在食品、水果和農田土壤中已廣泛檢出，可能造成的潛在風險引起公眾日益關注[35-36]。Pan等研究發現，苯醚甲環唑可以下調HepG2細胞中CYP3A4酶的mRNA表達水平，并且以劑量依賴的方式抑制酶的活性[37]。此外，苯醚甲環唑還可以顯著激活HepG2細胞中的凋亡相關蛋白caspase-8和caspase-9，并以劑量依賴的方式裂解DNA修復酶，同時對線粒體和內質網造成損傷[33]。因此，苯醚甲環唑作為一種重要的毒性化合物，其毒性作用的分子機制值得深入探究。

為探究農藥混合物的細胞毒性，本研究進行了等效應聯合暴露試驗。結果顯示：隨著農藥濃度增大，二元、三元農藥組合對細胞增殖毒性作用增強。已有研究表明，混合物聯合毒性可以通過單個組分的毒性效應進行預測評估。CA模型適用于具有相似作用模式的混合物體系，而IA模型則適用于具有相異作用模式的混合物體系[38]。近年來，CI指數法在環境中混合污染物風險評估方面得到了廣泛應用。Chen等應用這3類模型研究了丁草胺、莠去津和氯氰菊酯對蚯蚓Eisenia fetida的聯合毒性，發現CI法可以更準確地預測聯合毒性[39]。本研究也得到相同結果，表明CI模型可以作為生態毒理風險評估的有用工具。本研究基于CI指數分析發現，除烯酰嗎啉 + 苯醚甲環唑 + 氯氰菊酯和烯酰嗎啉 + 氯氰菊酯 + 啶蟲脒兩個三元組合外，其他農藥組合隨農藥劑量增大聯合效應具有拮抗轉為協同的趨勢。烯酰嗎啉 + 苯醚甲環唑 + 氯氰菊酯在5%～60%毒性效應下CI值為0.47～0.98，表明其聯合效應由協同作用逐漸轉為相加作用[40]。Tóth等評估了多種除草劑混合物對Aliivibrio fischeri的急性毒性，發現在EC50值濃度下，各農藥組合的CI值為0.12～0.77，說明待測混合物在急性毒性試驗中都產生協同的聯合作用，且作用強度從強到弱[41]。DRI值表示單獨與聯合暴露以達到相同毒性水平時所需農藥濃度的比值，可量化混合農藥之間的協同作用。本研究發現，低毒性水平下三元組合烯酰嗎啉 + 苯醚甲環唑 + 氯氰菊酯和烯酰嗎啉 + 氯氰菊酯 + 啶蟲脒協同效應產生中氯氰菊酯發揮了較大作用。Alassane-Kpembi 等基于DRI值量化真菌毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、雪腐鐮刀菌醇、鐮刀菌烯酮-X混合物對腸道上皮細胞的協同效應，結果表明：10%毒性效應水平下所有二元組合的劑量減少指數均高于30%毒性效應水平的，說明低毒性效應下二元組合協同作用更強；通過對三元組合中各組分在低毒性效應下的DRI值進行分析，發現鐮刀菌烯酮-X在混合物聯合效應中毒性較弱[30]。因此，DRI值有助于量化農藥單劑在混合物協同作用產生中的作用，對農藥聯合毒性評價具有重要意義。

聯合作用的概念最早由Bliss提出，后經Hewlett等補充研究。根據混合物中不同組分的作用靶點和作用機制，聯合作用主要包括相加作用、獨立作用和相互作用。區別在于：當各組分作用靶點相同且作用機制相似時發生相加作用；各組分作用靶點和作用機制均不同時發生獨立作用；當各組分作用靶點相同且作用機制會互相影響時會發生相互作用，從而產生更強 (協同) 或更弱 (拮抗) 的毒性[42-43]。因此確定混合體系中各農藥的作用靶點有助于更準確地判定農藥混合物的聯合效應。

細胞凋亡最初由Kerr于1972年提出，是多細胞生物程序性細胞死亡的一種形式，其中涉及多個基因的復雜調控[44-45]。細胞凋亡在維持機體穩態以及神經系統的發展中發揮著重要作用。一些證據表明，凋亡細胞的死亡可能導致各種病理問題和神經退行性病變，如腦缺血、阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮性脊髓側索硬化癥等[46]。因此，識別一些可能導致細胞凋亡的環境化合物至關重要。本研究中，對具有協同效應的兩個三元農藥混合物及相關單劑對細胞凋亡的誘導作用進行分析，結果表明各處理組均以劑量依賴的方式強烈地誘導細胞凋亡。Li等同樣發現，氨基甲酸酯類農藥會以時間和劑量依賴的方式誘導人T淋巴細胞和自然殺傷細胞凋亡[47-48]。據報道，Annexin-V染色可以根據細胞膜的改變在早期檢測細胞凋亡，常與PI聯合使用，利用成像流式細胞儀測定藥物對細胞凋亡的影響[49-50]。本研究采用高內涵篩選系統檢測能更直觀地觀察細胞狀態，適合高通量、多指標檢測，具有操作優勢[51]。細胞凋亡主要分為線粒體通路、死亡受體通路和內質網通路，這3條路徑相互關聯，一個通路上的某些因子可能會影響另一個通路[52]。包凌玲研究發現，苯醚甲環唑可以通過線粒體途徑和內質網應激途徑共同誘導HepG2細胞調亡[53]；Huang等探究了氯氰菊酯對巨噬細胞的毒性作用，結果表明，氯氰菊酯以劑量依賴的方式通過JNK/ERK途徑誘導巨噬細胞周期阻滯和凋亡而導致免疫細胞死亡[54]。目前對混合農藥的凋亡通路研究較少。本研究發現，在0.25 × EC50～EC50值濃度范圍內，相比于農藥單劑，三元組合烯酰嗎啉 + 氯氰菊酯 + 啶蟲脒可顯著誘導細胞凋亡，表現出協同效應，這與CI模型預測結果相同，證明該模型的可靠性。同樣地，Jia等發現，與單獨使用硫丹和代森鋅相比，暴露于混合物會增強細胞凋亡水平[55]。因此探究混合農藥的凋亡毒性及機制對污染物風險評估具有重要意義。

綜上所述，各農藥單劑和組合可以抑制HepG2細胞增殖，顯著誘導HepG2細胞產生凋亡作用，但是混合農藥誘導凋亡的作用機制尚不清楚，需要進一步通過細胞體外實驗和動物體內實驗探究其凋亡靶點和通路，為評估農藥多殘留聯合毒性機制提供科學依據。