中國人群原發性不寧腿綜合征新風險基因的相關性研究

黃 雷，陳 捷，黃豫萌，王 佩，馬建芳

不寧腿綜合征(Restless legs syndrome/William-Ekbom disease，RLS/WED)是一種神經系統疾病，其特征是患者出現想要活動雙腿的強烈沖動，伴或不伴有腿部感覺不適[1，2]。這種癥狀主要出現在平臥或靜坐等休息狀態，主要在夜間出現或夜間癥狀更明顯，持續行走可以緩解，可導致失眠影響患者生活質量[3]。研究表明歐洲和北美的成年人群的RLS/WED患病率為1.9%～4.6%[4]，然而亞洲國家RLS/WED 患病率顯著下降(約0.1%～3.9%)[5～9]。此外，RLS/WED 癥狀更易出現在鐵缺乏、腎功能不全、心血管疾病、糖尿病或偏頭痛人群中[10]。目前多巴胺能藥物是最有效的治療藥物，但長期服用多巴胺能藥物可能導致嚴重的副反應，如癥狀加重現象[11]。

RLS/WED 是一種復雜的疾病，環境和遺傳因素都可影響其表型，但其發病機制目前仍未明確，遺傳學研究為潛在發病機制提供了線索[12]。迄今為止，全基因組測序(Genome-Wide Association Study，GWAS)已經發現了6個風險基因點與不寧腿綜合征相關，包括MEIS1、BTBD9、PTPRD、MAP2K5/SKOR1、TOX3和Intergenic region of 2p14[13～16]。近期，一個納入了3個全基因組相關性研究的薈萃分析證實了之前報道的6個風險基因并發現了13個新的風險基因[17]。我們的團隊之前報道過中國人群中BTBD9和MAP2K5/SKOR1與RLS/WED 的聯系[18]。本次研究，我們選取了薈萃分析中發現的19個風險基因中的20個主要SNPs，研究其在中國人群中是否與RLS/WED 發病風險相關。

1 資料與方法

1.1 資料 研究人群：所有RLS/WED 患者均在門診招募，臨床癥狀符合國際不安腿綜合征研究組(International RLS study Group Rating Scale，IRLSSG)的診斷標準[3]，排除了繼發性RLS/WED，包括繼發于帕金森病、周圍神經病、腎功能不全、缺鐵、妊娠、肌痛和靜脈血粘滯等。缺鐵的判斷標準為血清鐵蛋白<30 ng/ml。IRLSSG 評分量表用于評估RLS/WED 的嚴重程度[19]。我們同時收集了RLS/WED 患者的家族史。對照人群是在社區招募，擁有相同種族背景的人群，所有人都接受了完整的神經系統檢查，排除了系統性疾病，震顫和其他運動障礙，并通過了RLS/WED 排除標準的評估且沒有 RLS/WED 家族史。該研究得到上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院倫理委員會的批準。所有參與者均簽署了知情同意書。

1.2 方法 DNA制備和基因分型：從患者組和對照組中每人收集2ml血液，采用苯酚-氯仿-異丙醇法提取DNA[20]。我們選擇了Schormair等的薈萃分析中報道的具有顯著性的20個主要單核苷酸多態性(包括rs12046503，rs10208712，rs113851554，rs1820989，rs80319144，rs1848460，rs35987657，rs17636328，rs61192259，rs10952927，rs1836229，rs62535767，rs340561，rs996064，rs111652004，rs868036，rs45544231，rs12450895，rs12962305，rs365032)[17]。其中的7個SNPs(rs12046503，rs1848460，rs61192259，rs10952927，rs62535767，rs340561，rs12450895)采用了Sanger 測序法進行基因分型。其他13個SNPs采用SNaPshot多重單堿基延伸SNP分型技術(Multiplex SNaPshot)進行基因分型。PCR產物采用磷酸化酶(FastAP)和核酸外切酶I(EXO I)純化，用ABI SNaPshot 多重分析試劑盒延長。延長產物采用磷酸化酶(FastAP)純化并負載至ABI3730xl。SNP的基因分型使用GeneMapper 4.0(Applied Biosystems)進行分析。

統計分析：使用SAS(9.4 TS1 M2版本；SAS Institute Inc，Cary，NC)軟件包進行統計分析。Wilcoxon 秩和檢驗用于比較RLS/WED患者和非RLS/WED對照之間的年齡差異。卡方檢驗用來比較組與組之間的性別構成比以及在總研究人群中的哈-溫平衡，所有SNPs 的等位基因頻率也通過卡方檢驗進行比較。我們評估了經性別和年齡矯正后的顯性模型，隱性模型和加性模型。采用logistic回歸進行基因型關聯分析，計算出每個SNP的比值比(odds ratio，OR)和95%的置信區間(confidence intervals，CI)。R語言(版本3.3.1)用于通過Bonferroni方法校正P值。運用Power and Sample Size Calculations(version 3.1.2)來計算檢驗效能[21，22]。遺傳功效是基于本研究中患者和對照人群的實際等位基因頻率。

2 結 果

本次研究總共納入了184例原發性RLS/WED患者和230例健康對照。人口學資料顯示，RLS/WED患者與對照組之間在年齡和性別上無統計學差異。31.6%的患者有RLS/WED家族史。在RLS/WED患者組，IRLSSG評分量表的平均分為(20.42±4.71)，平均鐵蛋白水平為(140.76±84.20) ng/ml(見表1)。

表1 病例和對照的人口統計信息

在檢測的20個SNPs中，有3個對照組的SNPs(rs1836229，rs996064，rs12450895)不符合哈迪-溫伯格平衡，2個SNPs(rs10208712，rs113851554)未見基因的多態變化。因此只有15個SNPs被納入最終的數據分析。所有的SNPs漏檢率都小于3.5%。研究中我們發現RLS/WED患者的rs365032等位基因G出現頻率高于對照組(OR=1.36，P=0.032)(見表2)。在經年齡和性別矯正后的顯性模型中，rs365032的基因型GG型和GA型相對于AA型(顯性模型)在RLS/WED患者中較高(OR=1.77，P=0.009)(見表3)。但是經Bonferroni 方法矯正后所有的差異均無統計學意義。其他SNPs的基因型或等位基因突變頻率也未發現有顯著差異。

表2 20個SNPs位點與RLS風險關聯分析

表3 年齡性別矯正后20個SNPs位點與RLS風險關聯分析

另外，為了確定這20個與RLS/WED相關的SNPs是否與性別有關，我們根據性別做了進一步的亞組分析。在女性組，RLS/WED患者的rs868036的等位基因T頻率高于對照組(OR=1.56，P=0.021)。在男性組，經過年齡矯正的加性模型顯示rs10952927存在等位基因劑量效應(OR=1.65，P=0.036)。但是Bonferroni 矯正后所有差異無統計學意義。

3 討 論

這是首次在中國RLS/WED人群中重復GWASs薈萃分析[17]發現的20個獨立關聯信號的研究。在中國人群中，我們沒有發現SNPs的基因型或等位基因突變頻率在RLS/WED患者和健康對照之間有明顯差異。

本研究中，我們發現rs365032的多態性與RLS/WED的發病風險相關，此外rs868036和 rs10952927的多態性分別在女性分組和男性分組顯示出與RLS/WED的相關性，盡管所有顯示的差異經Bonferroni矯正后無統計學意義。rs365032是MYT1上游的突變，MYT1在中樞和外周神經系統均有表達，有促進神經細胞分化的功能[23]。rs868036位于MAP2K5的內含子中，有趣的是，這個基因曾被報道與中國人群RLS/WED發病風險相關[18]。SNP rs10952927位于ZNF804B和ADAM22附近的風險基因，這兩個基因都與神經退行性疾病的發病機制相關[24，25]。但是，因為這3種SNPs的差異經多次矯正后無顯著性，以上的發現只是一些推測，還需大樣本或基礎研究來證實。

和本研究相似的是，在Guy等的研究[26]中，他們綜合了7個法國-加拿大大家族的全外顯子序列來探究位于19個風險位點內小于1Mb的基因上的可能導致蛋白質改變的潛在致病突變。但他們沒有發現任何與RLS/WED風險相關的非同義突變。他們研究的家族出現RLS/WED可能是由于19個風險位點的非編碼調節區域出現了突變或者存在尚未發現的風險位點。

我們的研究存在一定的局限性。首先，病例組和對照組的樣本量小，降低了研究的說服力，且可能導致由膨脹效應引起的假陰性。第二，因為資金限制，我們只檢測了GWASs薈萃分析中報道的風險基因的主要SNPs。這些風險基因可能還有其他的具有顯著性的突變，而不同的人種中相同危險基因的SNP也并不相同，這需要通過進一步大樣本的全基因組測序來確定。第三，我們采用自我報告的形式判斷種族背景而不是進行遺傳學祖源檢驗，這使得我們研究的人群中可能存在種族背景的亞組。總之，我們的研究并沒有在中國人群中復制出19個風險基因的主要SNPs與RLS/WED發病風險的聯系。種族的異質性和樣本量小可能是我們的研究結果不同于GWASs薈萃分析結果的原因。未來還需要大規模的全外顯子測序，甚至全基因組測序來探索中國人群的19個風險基因的潛在致病突變。