α7-nAChR/PI3K/AKT/GSK-3β通路在慢性睡眠剝奪后的保護作用及其機制研究

萬亞會，呂夢頔，李 征，張 軒，周凱麗，吳 偉，薛 蓉

睡眠剝奪可以誘導一系列免疫炎癥反應，可使外周血中促炎因子釋放增多，而睡眠恢復后血中促炎因子仍持續存在[1]。越來越多的研究表明，在中樞神經系統內，睡眠剝奪能激活星形膠質細胞和小膠質細胞，導致促炎癥因子水平升高，造成神經損傷[2，3]。此外，睡眠剝奪后大腦也產生氧化應激損傷。雖然神經炎癥和氧化應激都是造成睡眠剝奪不良反應的關鍵因素，但目前對減輕這些因素的調節機制知之甚少。

在中樞神經系統和外周系統，α7-煙堿乙酰膽堿受體(α7-nAChR)是一個重要的調節免疫反應和氧化應激的調節因子[4]。α7-nAChR不僅是傳統的配體門控性離子通道，還能參與學習的過程，如記憶的鞏固、運動和注意力[5，6]。刺激α7-nAChR可引起多個胞內信號通路的激活[7～9]，在α7-nAChR下游，激活的PI3K / AKT信號通路抑制糖原合酶-3β(GSK-3β)[10，11]，進而導致轉錄因子 Nrf-2 和抗氧化劑酶HO-1的表達、抑制促炎細胞因子的釋放[12～14]。然而，α7-nAChR及其下游PI3K / AKT/GSK-3β信號通路在睡眠剝奪中的作用機制仍尚不明確。因此，本研究旨在探討睡眠剝奪7 d對α7-nAChR的表達和下游神經膠質細胞的PI3K / AKT/GSK-3β信號通路活性的影響，并探討選擇性α7-nAChR受體激動劑PHA - 543613對睡眠剝奪誘發的炎癥和氧化應激反應的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性C57BL/6J小鼠，7～8周齡，體重在20～23 g之間，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。每籠6只群居飼養，至于室溫(22±2)℃，12：12 h晝夜循環光照，自由進食、飲水。動物于實驗前適應實驗環境1 w。

1.2 主要儀器及試劑 (1)高速低溫離心機(日立 HITACHI 型號)，超聲(Thermo Forma公司，美國)，微量分光光度計(Thermo NANODROP2000)，PCR熱循環儀K640(杭州晶格科學儀器有限公司)，電泳儀(Bio-Rad公司，美國)，冰凍切片機(Leica公司，德國)，免疫熒光顯微鏡(Nikon公司，日本)。(2)大鼠抗小鼠α7-nAChR抗體(Santa Cruz Biotechnology公司)，兔抗小鼠 p-AKT(CST公司，美國)，兔抗小鼠p-GSK3β(CST公司，美國)，兔Nrf2(Abcam公司，英國)，兔抗HO-1(Abcam公司，英國)，HRP標記的山羊抗大鼠IgG抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)，山羊抗小鼠IBA-1抗體(Abcam公司，英國)，兔抗小鼠GFAP抗體(Abcam公司，英國)，Alexa Fluor 488 羊抗兔IgG(Abcam公司，英國)，Alexa Fluor 488 AffiniPure 驢抗山羊IgG(Jackson公司，美國)，Alexa Fluor 546 AffiniPure 驢抗大鼠IgG(Jackson公司，美國)，PHA-543613(sigma公司，美國)。

1.3 實驗方法 動物分組：C57BL/6J小鼠隨機分為3組，每組24只，對照(CC)組：適宜環境下飼養1 w；慢性睡眠剝奪(SD)組：適宜環境下飼養1 w，利用改良多平臺水環境法進行慢性睡眠剝奪7 d；慢性睡眠剝奪后腹腔注射α7-nAChR激動劑-PHA-543613(SD+PHA-543613)組：適宜環境下飼養1 w，利用改良多平臺水環境法進行睡眠剝奪7 d，睡眠剝奪結束后6 h腹腔注射α7-nAChR受體激動劑PHA-543613(6mg/kg)，連續腹腔注射3 d后處死，CC組于處死前3 d連續腹腔注射等量的生理鹽水，CC組與SD組均于睡眠剝奪結束后同時處死。

1.4 慢性睡眠剝奪模型的建立 使用改良多平臺水環境法(modified multiple platform method，MMPM)對小鼠進行慢性睡眠剝奪[15，16]，睡眠剝奪箱長50cm、寬30cm、高30 cm，剝奪箱內均勻放有8個圓形平臺，直徑3 cm，高8 cm，平臺間隔7 cm；造模前向剝奪箱內加水至平臺下方約1 cm處，水溫保持在(22±2)℃，剝奪箱頂部放置水和食物，小鼠可在平臺間自由活動、攝食及飲水，每天定時更換水以保持清潔。睡眠剝奪過程保證12 h光照(9：00～21：00)、12 h黑暗(21：00～9：00)的晝夜節律，控制睡眠剝奪箱內溫度20～24 ℃，相對濕度60%，保持環境無明顯噪音。造模開始前3 d每天定時把SD組的小鼠放在睡眠剝奪水箱內適應環境，每天適應2 h。睡眠剝奪過程從9：00開始，每天17：00～21：00把小鼠從剝奪箱中拿出，放至原來的鼠籠中休息4 h，連續睡眠剝奪7 d。

1.5 免疫熒光染色檢測星形膠質細胞和小膠質細胞表面α7-nAChR的表達 三組小鼠腹腔注射10%的水合氯醛進行麻醉，麻醉成功后使用冰PBS灌注，直至肝臟變白、自右心耳流出為澄清液體，斷頭取腦，沿冠狀縫和矢狀縫取出顱骨，暴露腦組織，先于4%多聚甲醛浸泡過夜，進行固定，再先后置于15%和30%的蔗糖溶液中梯度脫水，脫水成功后切除額極和腦干，包埋腦組織，冰凍切片機下連續切片，取各組海馬組織切片，每只小鼠各取5片，切片厚度為8 μm。海馬組織切片經固定、破膜，與大鼠抗小鼠α7-nAChR抗體(1∶100)、山羊抗小鼠IBA-1抗體(1∶500)，兔抗小鼠GFAP抗體(1∶1000)4 ℃孵育過夜，次日與山羊抗兔IgG(FITC)(1∶1000)，驢抗大鼠IgG(Alexa Fluor 596)(1∶500)，驢抗山羊IgG(Alexa Fluor 488)(1∶500)室溫避光孵育1 h，DAPI封片，免疫熒光顯微鏡觀察，計數α7-nAChR與星形膠質細胞和小膠質細胞的共表達的陽性細胞數。

1.6 Western 印跡法檢測蛋白表達 分離三組小鼠海馬組織，加入裂解液，使用超聲粉碎，于4 ℃離心機14000 r/min，離心30 min，吸取上清，BCA蛋白試劑盒測定蛋白濃度。等量蛋白經電泳轉到聚亞乙烯雙氧化物膜(PVDF)上，蛋白條帶加入大鼠抗小鼠α7-nAChR抗體(1∶200)兔抗小鼠- p-AKT(1∶1000)，兔抗小鼠-AKT(1∶1000)，兔抗小鼠-p-GSK3β(1∶1000)，兔抗小鼠-GSK(1∶1000)，兔抗小鼠-Nrf2(1∶2000)，兔抗小鼠-HO-1(1∶1000)，4 ℃慢搖孵育過夜，次日與HRP標記的山羊抗大鼠IgG抗體(1∶5000)室溫慢搖孵育1 h，ECL超敏發光混合液進行凝膠成像拍照。

1.7 實時熒光定量PCR(Rt-PCR)檢mRNA表達 分離三組小鼠海馬組織，使用Trizol試劑提取RNA，紫外分光光度計檢測RNA濃度。加入逆轉錄反應體系，將RNA逆轉錄合成cDNA第一條鏈，再向cDNA模板中加入PCR預混液進行PCR擴增，Bio-Rad檢測目的基因的相對表達水平，通過比較CT值獲得目的基因的相對表達水平(見表1)。

表1 (加標題)

1.8 行為學評估 Morris 水迷宮通過檢測實驗動物的空間定位來評估其學習記憶能力。水迷宮高0.5 m，直徑1.5 m，里面裝滿水，用白色染料將水染白，溫度保持在(24±1)℃，水下1 cm 有一個可以移動的平臺，應用計算機系統將水面等分為4 個象限，可移動平臺置于第一象限中央，用攝像頭采集小鼠在水迷宮里運動的參數。本實驗依據小鼠定位航行實驗中逃避潛伏期和空間探索實驗中的穿越平臺次數和處于目標象限時間、平均游泳速度來評價小鼠的學習記憶能力。

定位航行實驗：小鼠每天進行4 次不同象限實驗學習，每次實驗時，實驗平臺位于相同的位置。每次實驗在小鼠爬上平臺2 s或游泳60 s后結束。如果動物在60 s后沒有找到平臺，將它放到平臺上學習20 s，然后進行下只小鼠試驗。小鼠于睡眠剝奪開始后每天進行定位航行訓練，早晨8：30 開始進行。第4次試驗結束后，這些動物被保溫1 h，然后放回到睡眠剝奪箱里。利用計算機軟件計算動物到達平臺的逃逸潛伏期和運行軌跡。空間探索實驗：在小鼠慢性睡眠剝奪7 d后早晨8：30，所有小鼠進行空間探索實驗，將水迷宮中的平臺撤去，將小鼠面朝桶壁扔進水里(除第一象限外)，用計算機記錄小鼠在90 s 內處于目標象限時間、穿越平臺次數、游泳時間及運行軌跡等。

2 結 果

2.1 慢性睡眠剝奪后抑制α7-nAChR的表達和PI3K/AKT/ GSK-3β通路 慢性睡眠剝奪7 d后，SD組小鼠海馬組織的α7-nAChR蛋白表達量、mRNA表達較CC組明顯下降，差異具有統計學差異(P=0.001，P=0.038)(見圖1)。慢性睡眠剝奪7 d后，SD組小鼠海馬組織p-AKT蛋白表達量較CC組降低，差異具有統計學差異(P=0.019)，p-GSK-3β蛋白表達量較CC組升高，差異具有統計學差異(P=0.011)(見圖2)。

A：蛋白印跡法檢測小鼠海馬α7-nAChR蛋白表達；B：α7-nAChR/β-action灰度值的比較，β-action為內參；C：α7-nAChR的mRNA表達的量化比較

A、C：蛋白印跡法檢測小鼠海馬p-AKT、p-GSK-3β、AKT、GSK-3β蛋白表達；B、D：p-AKT、p-GSK-3β、AKT、GSK-3β/GAPDH灰度值的比較，GAPDH為內參；*P<0.05，**P<0.01

2.2 激活α7-nAChR誘導PI3K/AKT/GSK-3β通路的激活 慢性睡眠剝奪后腹腔注射PHA-543613后，SD組與SD+PHA-543613組比較，星形膠質細胞表面α7-nAChR的表達較SD組升高(P=0.027)，SD+PHA-543613組小膠質細胞表面α7-nAChR的表達較SD組也增多，但差異無統計學意義(見圖3A，B)。慢性睡眠剝奪后腹腔注射PHA-543613后，SD+PHA-543613組海馬組織的p-AKT蛋白表達量較SD組增多，差異具有統計學意義(P=0.047)，SD+PHA-543613組海馬組織的p-GSK-3β蛋白表達量較SD組增多，差異具有統計學意義(P=0.017)(見圖 3C，D)。

A：免疫熒光檢測三組小鼠海馬組織α7-nAChR與GFAP、IBA1的共表達；B：三組小鼠海馬組織α7-nAChR與GFAP共表達、α7-nAChR與IBA1共表達的陽性細胞定量分析，紅色熒光標記α7-nAChR，綠色熒光分別標記GFAP+星形膠質細胞和IBA1+小膠質細胞。C：蛋白印跡法檢測小鼠海馬p-AKT、p-GSK蛋白表達；D：p-AKT、p-GSK /GAPDH灰度值的比較，GAPDH為內參；*為CC組與SD組比較，#為SD組與SD+PHA組比較，* P<0.05，**P<0.01；#P<0.05，##P<0.01

2.3 激活α7-nAChR減輕慢性睡眠剝奪后炎癥反應和氧化應激 慢性睡眠剝奪7 d后，SD組海馬組織的Nrf-2、HO-1蛋白表達較CC組明顯下降，差異具有統計學意義(P=0.020，P=0.016)(見圖4)，同時炎性因子TNF-α、MCP-1mRNA表達較CC組明顯增多、抑炎因子CD206、TGF-βmRNA表達較CC組減少，差異均具有統計學意義(均P<0.01)(見圖5A)。腹腔注射PHA-543613后，SD+PHA-543613組海馬組織的Nrf-2和HO-1蛋白表達、CD206、TGF-βmRNA表達較SD組增多，差異具有統計學意義(P<0.05)(見圖4、圖5B)，而TNF-α、MCP-1 mRNA表達較SD組明顯下降，差異具有統計學意義(均P<0.01)(見圖7A)。

A：蛋白印跡法檢測小鼠海馬Nrf-2、HO-1蛋白表達；B：Nrf-2、HO-1/β-action灰度值的比較，β-action為內參

注：*為CC組與SD組比較，#為SD組與SD+PHA組比較* P<0.05，**P<0.01；#P<0.05，##P<0.01；A：炎性因子mRNA表達的量化比較；B：抑炎因子 mRNA表達的量化比較

注：*為CC組與SD組比較，#為SD組與SD+PHA組比較*P<0.05，**P<0.01；#P<0.05，##P<0.01；A，B：三組小鼠逃避潛伏期的比較；C：三組小鼠游泳速度的比較；D：三組小鼠處于目標象限時間的比較；E：三組小鼠穿越平臺次數的比較

2.4 激活α7-nAChR改善慢性睡眠剝奪后的認知功能下降 慢性睡眠剝奪后，SD組較CC 組逃避潛伏期延長、穿越平臺次數減少、處于目標象限時間縮短，差異有統計學意義(P=0.000，P=0.000，P=0.000)；腹腔注射PHA-543613后，SD+PHA-543613組組較SD組逃避潛伏期縮短、穿越平臺次數增多、處于目標象限時間延長，差異有統計學意義(P=0.000，P=0.000，P=0.001)。各組小鼠游泳速度無統計學差異。

3 討 論

本研究首次證實刺激α7-nAChR能減輕慢性睡眠剝奪后炎癥和氧化應激反應。慢性睡眠剝奪后引起海馬α7-nAChR表達下調、PI3K / AKT / GSK-3β信號通路處于抑制狀態。PHA-543613處理后誘導α7-nAChR表達上調和PI3K/AKT/GSK-3β信號通路的激活，同時海馬的神經炎癥和氧化應激均減輕，改善小鼠認知功能。這些結果表明α7-nAChR可以作為慢性睡眠剝奪后海馬神經炎癥和氧化應激的觸發點之一，刺激α7-nAChR可能對睡眠剝奪產生保護作用。

在中樞神經系統，α7-nAChR主要分布在神經元[17，18]。越來越多的研究發現星形膠質細胞[19]和小膠質細胞[20，21]、T細胞[22]、B細胞[23]和單核細胞[24]表面上也有α7-nAChR的表達。小膠質細胞和星形膠質細胞是腦內主要的免疫炎性細胞，具有抗原呈遞和產生促炎或抗炎因子等多種功能[25～27]。慢性睡眠剝奪會激活小膠質細胞和星形膠質細胞[3，28]，因此小膠質細胞和星形膠質細胞可能成為限制睡眠剝奪后大腦炎癥和氧化應激的潛在靶點。

我們的實驗證實α7-nAChR在小膠質細胞和星形膠質細胞表面均有表達，與既往文獻報道一致。慢性睡眠剝奪后，α7-nAChR在小膠質細胞和星形膠質細胞的表達減少，促炎因子釋放增加，而抗炎因子和抗氧化酶表達減少。腹腔注射α7-nAChR受體激動劑PHA-543613干預改變小膠質細胞和星形膠質細胞的反應，使抗氧化酶和抑炎因子的表達和釋放增多，促炎因子表達減少，削弱炎癥和氧化應激反應。通過水迷宮對小鼠行為學進行評估，發現慢性睡眠剝奪后小鼠認知功能下降，而在PHA-543613處理后認知功能改善。這些實驗結果提示α7-nAChR可能通過調節炎癥反應和氧化應激為睡眠剝奪引起的損傷提供保護作用。

PI3K/AKT/GSK-3β作為α7-nAChR下游的一條重要信號通路，因此本實驗進一步探索了慢性睡眠剝奪后α7-nAChR下游PI3K / AKT / GSK-3β的狀態，實驗結果表明，慢性睡眠剝奪后p-AKT表達減少、p-GSK-3β表達增多，PI3K / AKT / GSK-3β信號通路處于抑制狀態，經PHA-543613處理后p- AKT、p-GSK-3β表達均增多，該信號通路被激活。這些結果均提示α7-nAChR可能通過調節小膠質細胞和星形膠質細胞PI3K / AKT / GSK-3β抑制神經炎癥反應和氧化應激為睡眠剝奪引起的損傷提供保護作用。但值得注意的是巨噬細胞[7]和單核細胞[24]表面也表達α7-nAChR，而PHA-543613也可能作用于這些細胞以減少睡眠剝奪后的炎癥反應和氧化應激，睡眠剝奪后α7-nAChR調節炎癥反應和氧化應激的機制仍需進深入研究。

既往研究結果表明，α7-nAChR可以通過PI3K / AKT / GSK-3β減輕炎癥損傷[29～35]。在腦出血大鼠模型中，α7-nAChR受體激動劑通過PI3K / AKT / GSK-3β通過改善大鼠腦出血后24 h和72 h的神經功能和減輕腦水腫，發揮神經保護作用[30]，并且還可以保護血腦屏障的完整性[10，30]。在心肌缺血再灌注模型中，α7-nAChR受體激動劑可以激活p38MAPK和JNK信號通路，減少ROS生產、增加細胞的ATP，進而減少心肌組織損傷和改善心臟收縮功能[31]。Eran Nizri等也發現實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型中，α7-nAChR通過抑制炎癥因子的釋放緩解大鼠的癥狀[32]。我們研究結果同樣證實PHA-543613治療顯著降低了慢性睡眠剝奪后促炎因子的釋放，增加抗炎因子和抗氧化酶的表達。這些結果與先前的報告證明α7-nAChR提供類似的神經保護作用。我們仍發現，PHA -543613顯著增加了慢性睡眠剝奪后的抗氧化酶Nrf-2和HO-1的表達。Nrf-2和HO-1是抑制氧化應激的主要抗氧化酶，動物實驗證明，Nrf-2和HO-1具有抗炎作用，抑制炎癥因子的釋放，如TNF-α，IL-1β和MIP-1，在抗氧化應激中起著重要的作用[36～38]。然而Nrf-2和HO-1表達的增加是否進參與慢性睡眠剝奪后抑制炎性因子的釋放、促進抗炎因子的釋放，有待進一步研究。

綜上所述，慢性睡眠剝奪抑制α7-nAChR的表達，而刺激α7-nAChR通過激活PI3K / AKT / GSK-3β能減輕慢性睡眠剝奪后的神經炎癥和氧化應激，對睡眠剝奪起保護作用，但仍有待進一步研究證實。